短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达以及酶学研究

发布时间：2021-04-01 10:39

　　漆酶（EC 1.10.3.2,p-diphenol:dioxygen oxidoreductase）是一种含铜氧化还原酶,它能够催化多种底物并且氧化底物产生的自由基可以进行非酶反应。因此,漆酶在多个工业领域实际应用中显示出巨大的潜力。但细菌漆酶在实际应用中中存在产量低等缺点,为了获得稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,对前期筛选的具有漆酶活性的菌株LCO1通过形态特征、生理生化实验和16S rDNA等方法进行鉴定,并进一步研究其生长特性。采用序列分析和生物信息学软件对漆酶的氨基酸组成、分子量、等电点及二级结构等进行分析。通过PCR扩增出漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,使用毕赤酵母菌株进行高效分泌表达,获得产量较高的漆酶并简化后续纯化工艺。菌株LCO1的16S rDNA序列长度为1512 bp,鉴定该菌株为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus LCO1,该漆酶共有510个氨基酸,分子量58.71,二级结构分析发现含有25.88%的延伸链,60.78%的无规则卷曲,5.88%的β-转角和7.45%的α-螺旋。菌株LCO1的最适生长温度为30℃,最适生长的pH为7.... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２细菌漆酶铜活性位点和电子传递过程［２１］??Ｆｉ．?１－２?Ｃｏｅｒ?ｓｉｔｅｓ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｌａｃｃａｓｅ?ａｎｄ?ａ?ｅｌｅｃｔｒｏｎａｔｈｗａ＾２１１??

Ｆｉｇ．?１－４?ｐＰＩＣＺａＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??３．１表达载体的选择??表达载体基本为大肠杆菌／毕赤酵母穿梭载体，大肠杆菌表达载体一般具有大小为１??右的ＡＯＸ１表达组件，如５＇ＡＯＸｌ启动子，３＇ＡＯＸｌ终止子，启动子和终止子之间??个或多克隆位点序列（外源编码序列的插入）等。常用的载体选择可以根据蛋白表??置为胞内或者胞外表达或者质粒是否需要进行诱导来选择合适的表达载体。??３．２表达宿主菌的选择??常用的毕赤酵母表达宿主菌包括ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、ＫＭ７１和ＭＣ１００－３等，大部分??营养缺陷型菌株，在选择宿主菌时，一些缺乏蛋白酶缺陷性菌株成为表达系统的首??这样可以减少胞外表达的外源蛋白的降解，提高目的蛋白表达水平，另一方面，宿??所表达的背景蛋白越少越有利于后续蛋白的分离和纯化。??３．３毕赤酵母的高密度发酵??毕赤酵母表达系统可以实现基因工程菌的高密度发酵，其过程一般分为两个阶??菌体的扩増阶段和甲醇诱导阶段。在菌体生长阶段，一般以葡萄糖和甘油为碳源的??培养基进行培养，菌体密度达到一定要求后进入到第二阶段，也就是甲醇诱导表达??

?２．３．１．２?菌株?ＬＣ０１?的?１６Ｓ?ｒＤＮＡ?结果??通过细菌基因组提取试剂盒获得ＬＣ０１基因组ＤＮＡ，电泳结果如图２－２，基因组获??得率较高，条带清晰无降解，质量和浓度能够满足实验需要。１６Ｓ?ｒＤＮＡ电泳结果如图??２－３。条带位于１５００?ｂｐ左右，目的ＤＮＡ条带清晰，带型完整，没有弥散，表明ＤＮＡ??样品纯度较高，无降解及核酸酶污染问题。??－１６－??


本文编号：3113197