解脂耶氏酵母赤藓糖还原酶基因的克隆与功能鉴定及利用代谢工程手段提高其合成赤藓糖醇

发布时间：2021-04-02 03:08

　　解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种非常规酵母（Nonconventional yeast）,是国际上工业生产赤藓糖醇的常用菌之一,也是我国企业生产赤藓糖醇唯一使用的菌株。赤藓糖醇因其不致龋齿性和低热量,被认为是一种优良的蔗糖替代品。合成赤藓糖醇的出发原料为葡萄糖,经过磷酸戊糖途径,生成中间产物D-赤藓糖,赤藓糖还原酶（ER）在辅因子NADPH的辅助作用下,能够催化D-赤藓糖为赤藓糖醇,该酶是赤藓糖醇合成途径中的一种关键酶。然而在产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母中,ER基因仍未被克隆鉴定,因此克隆鉴定该基因对于进一步提高解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇的性能具有重要的价值。本次研究总共从产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母中鉴定了三种赤藓糖还原酶基因,分别是ER10、ER25、ER27,并将它们在大肠杆菌中异源表达。三种赤藓糖还原酶之间的氨基酸同源性小于35%,且都以NADPH作为辅因子。此外表征这三种赤藓糖还原酶的酶学性质,ER25酶催化速率最大,酸性环境对于酶活性更有利。敲除ER10、ER25、ER27基因的菌株依然能够利用葡萄糖合成赤藓糖醇,但其生产率和转化率都显著降低。同时敲除三种... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

赤藓糖醇的化学结构式Fig.1-1Chemicalformulaoferythritol.

上海交通大学硕士学位论文4图1-2TrichosporonoidesmegachiliensisSN-G42中赤藓糖醇合成的磷酸戊糖途径[54]Fig.1-2HypotheticalpathwayoferythritolproductioninTrichosporonoidesmegachiliensisSN-G42[54].注：G6P,葡萄糖-6-磷酸;F6P,果糖-6-磷酸;GA3P,3-磷酸甘油醛;Ru5P,核酮糖-5-磷酸;R5P,核糖-5-磷酸;S7P：7-磷酸景天酮糖;E4P,赤藓糖-4-磷酸;TPP,硫胺素焦磷酸盐;E4PK,赤藓糖-4-磷酸酸激酶;6PGN,6-磷酸葡萄糖酸;X5P,木酮糖-5-磷酸。整个的赤藓糖醇的发酵过程，是以葡萄糖为底物，经过ppp途径，生成中间产物4-磷酸赤藓糖，4-磷酸赤藓糖经过4-磷酸赤藓糖激酶的去磷酸化作用，生成赤藓糖，最后经过赤藓糖还原酶催化，还原为赤藓糖醇。因为赤藓糖还原酶是生产赤藓糖醇的反应中最后一步唯一的一种酶，因此被认为是整个反应的关键酶。目前我国生产赤藓糖醇的唯一工业酵母菌株为解脂耶氏酵母，其工业转化率可达52%，理论转化率可达68%。但解脂耶氏酵母种的赤藓糖还原酶并未得到克隆鉴定，因此鉴定出赤藓糖还原酶对于工业生产赤藓糖醇意义重大。

上海交通大学硕士学位论文15图2-1HPLC检测被含ER的大肠杆菌的粗酶液催化后的产物；Fig.2-1HPLCanalysisofreactionproductcatalyzedbythecrudeextractsofE.colicontaining.A:D-赤藓糖标样；B:ER10反应产物；C:ER25反应产物；D:ER27反应产物；E:赤藓糖醇标样。


本文编号：3114472