循环肺癌细胞基因变异和PD-L1表达异质性分析

发布时间：2021-04-02 07:00

　　背景:由于肿瘤异质性,常导致肿瘤靶向治疗（如EGFR）和抗PD-1治疗的反应差异性和失败。传统的原发灶单点组织活检,仅代表部分肿瘤细胞克隆或亚克隆,缺乏转移灶信息。循环肿瘤细胞（CTCs）理论上来自体内多部位肿瘤,具有更好的代表性,含盖信息更为全面,肿瘤突变异质性可表现在CTCs基因组中,深入单个CTCs水平研究,有助于最终阐明肿瘤异质性现象和解析肿瘤进程中基因组发生的动态和持续性突变演化全貌。研究方法:1. 单个CTCs分离技术及肺癌患者检测。基于Cell Search原理,优化Ep CAM抗体,改进细胞破膜环节,肺癌患者抗凝外周血5ml,用Ep CAM免疫磁珠富集CTCs,经Ep CAM荧光信号放大、CD45、PD-L1和Hoechst免疫荧光染色鉴定CTCs,衔接显微操作分离单个CTCs,进行单细胞水平基因组DNA提取和扩增,采用肺癌72个靶基因定向测序,分析各基因突变拷贝数变异（CNV）和基因突变位点,进一步确证CTCs。共入组98例肺癌患者,分析临床检测CTCs效能。2. 肺癌组织与单个CTCs基因突变异质性分析。（1）EGFR基因突变异质性分析组织存在EGFR靶向治疗敏感突... 

【文章来源】：北京市结核病胸部肿瘤研究所北京市

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抗人CD326抗体对人肺癌细胞系NCI-H2009免疫荧光染色

北京市结核病胸部肿瘤研究所博士学位论文26图1抗人CD326抗体对人肺癌细胞系NCI-H2009免疫荧光染色。不加CD326免疫磁珠组直接用荧光抗体染色。加CD326磁珠组，用CD326磁珠4℃孵育30min，离心洗涤2次后再用荧光抗体染色（10×10倍）。图2anti-MousepAb与外周血白细胞结合试验。人外周血用红细胞裂解液去除红细胞，加CD326免疫磁珠4℃孵育30min，洗涤2次后，再用anti-MousepAb-dylight488染色（10×10倍）。2.掺入试验优化的CTCs染色方案经过优化后，确定EpCAM(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342方案进行染色。肺癌细胞NCI-H2009掺入健康人外周血中，经过红细胞裂解、CD326磁珠富集

北京市结核病胸部肿瘤研究所博士学位论文27肺癌细胞，用荧光抗体进行染色，染色结果如图3所示。EpCAM染色明亮，境界清晰，所掺入的肺癌细胞均能显色，且未发现白细胞的非特异性结合。图3为EpCAM(CD326)染色结果，显示利用小鼠抗人CD326磁珠作为一抗，GoatAnti-MousepAb（dylight488）作为二抗染色，避免了抗CD326荧光抗体与抗CD326磁珠表位竞争。图3优化染色方案染色外周血掺入的肺癌系NCI-H2009。经CD326免疫磁珠富集后，用免疫荧光抗体(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342染色（20×10倍）。3.肺癌患者CTCs的鉴定肺癌患者的外周血，经红细胞裂解及CD326免疫磁珠富集CTCs后，随后采用上述优化后的染色方案检测CTCs。以EpCAM(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342进行染色，CTCs判定标准即为EpCAM+/Hoechst+/CD45-；白细胞（WBC）判定标准为EpCAM-/Hoechst+/CD45+。图4所示为肺癌患者CTCs荧光显微镜下成像图。我们衔接MMI-CellEctorPlus单细胞挑选平台，将染色鉴定的肺癌患者CTCs分

【参考文献】：
期刊论文
[1]单细胞测序技术及其在肿瘤研究和临床诊断中的应用[J]. 周莹,黄华艺.  分子诊断与治疗杂志. 2017(03)



本文编号：3114818