利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻淀粉合成相关基因AGPS1的研究
发布时间：2021-04-04 21:50
成熟水稻种子胚乳中的淀粉含量约占种子干重的80%,因而稻米食味品质受淀粉品质直接影响。淀粉由支链淀粉和直链淀粉组成,淀粉合成过程受一些列酶调控。淀粉合成的底物是ADPG,由ADP-Glc焦磷酸化酶（AGPase）催化合成,起催化作用的部位位于该酶的小亚基AGPS。本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻淀粉合成相关基因AGPS1进行编辑,得到以下结论:1、本研究中以粳稻品种“嘉花1号”（JH）为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术成功对AGPase的一个小亚基基因AGPS1（LOCOs08g25734）进行了编辑,获得了插入一个碱基C的编辑植株,也证明了利用CRISPR/Cas9技术改变水稻淀粉品质的可行性。2、T1代共有4株苗存活,将其命名为k1、k2、k3、k4,单独收取其种子,并进行自交繁殖后代。k1后代始终保留了转基因载体,k2、k3、k4获得了剔除转基因载体的突变体。3、分别对突变体k1和k4的种子中与淀粉合成相关的11个基因进行转录水平的表达量分析。突变体k1在发育后期GBSSⅡ、SBE1、SBE3基因的表达量明显高于野生型...
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
单靶点U6a-T-gRNA表达盒构建和扩增模式图
上海师范大学硕士学位论文材料与方法13③回收纯化U6a-T-gRNA表达盒对U6a-T-gRNA表达盒的克隆产物进行电泳分析，对约600bp位置的电泳条带进行切胶回收纯化（本实验胶回收均使用康为世纪公司的胶回收试剂盒），然后以B1/BL为引物进行扩增并送公司测序验证，验证正确的U6a-T-gRNA表达盒放置于-20℃保存备用。④连接MH终载同样采用边切边连的方法将gRNA表达盒连入MH最终载体。以上一步验证正确的U6a-T-gRNA表达盒纯化产物作为原料，反应体系和反应条件如下：U6a-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图如下：图2-3单靶点U6a-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图（3）双靶点质粒载体构建构建双靶点载体的过程也分为构建、扩增、回收纯化gRNA表达盒以及连接MH终载。构建双靶点gRNA表达盒时，分别将第一个和第二个靶点接头引物与U6a质粒和U6b质粒连接构成U6a-T-gRNA表达盒和U6b-T-gRNA表达盒。反应体MH质粒2μlU6a-T-gRNA4μlBsaⅠ1μlBsaⅠbuffer1μlT4连接酶1μlT4buffer3μlddH2O3μl总体积15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反应条件15个循环
上海师范大学硕士学位论文材料与方法15构建并扩增U6a-T-gRNA与U6b-T-gRNA表达盒的模式图如下：图2-4双靶点U6a-T-gRNA与U6b-T-gRNA表达盒构建和扩增模式图对第二轮克隆产物进行电泳，带长为600bp左右的是U6a-T-gRNA表达盒，U6b-T-gRNA表达盒电泳带长为500bp左右，分别切胶回收纯化。然后分别以引物B1/B2扩增U6a-T-gRNA表达盒纯化产物，以引物B2’/BL扩增U6b-T-gRNA表达盒纯化产物，并测序验证。构建双靶点MH终载时，将测序验证后的U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表达盒混合在一起通过边切边连的方法连接到MH终载质粒上。反应体系和反应条件如下：U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图如下：MH质粒4μlU6a-T-gRNA3μlU6b-T-gRNA3μlBsaⅠ0.5μlBsaⅠbuffer1.5μlT4连接酶0.5μlT4buffer2.5μl总体积15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反应条件15个循环
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系[J]. 白建江,张建明,朴钟泽,方军,李刚燮,王亚,杨瑞芳. 分子植物育种. 2018(05)
[2]转基因技术改良水稻淀粉品质研究进展[J]. 丁一,丁箐雯,李冰清,沈易,张宁,吴殿星. 中国稻米. 2018(01)
[3]CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因[J]. 汪秉琨,张慧,洪汝科,张锦文,杨睿,罗琼,曾千春. 中国水稻科学. 2018(01)
[4]CRISPR/Cas9系统:基因组定点编辑技术及其在植物基因功能研究中的应用[J]. 包爱科,白天惠,赵天璇,苏家豪. 草业学报. 2017(07)
[5]水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展[J]. 陈雅玲,包劲松. 中国水稻科学. 2017(01)
[6]水稻种子淀粉合成及其调控研究进展[J]. 彭波,庞瑞华,孙艳芳,李慧龙,宋晓华,周棋赢,宋世枝,李梁浩,江毅丹,袁红雨. 江西农业学报. 2016(06)
[7]CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展[J]. 陈伟潘. 南方农业. 2015(03)
[8]高温对水稻胚乳淀粉合成关键酶活性及内源激素含量的影响[J]. 张桂莲,廖斌,武小金,肖应辉,肖浪涛,陈立云. 植物生理学报. 2014(12)
[9]胚乳中淀粉的合成[J]. 刘德瑞,蔡秀玲. 植物生理学报. 2011(11)
[10]直链淀粉和支链淀粉的表征[J]. 李海普,李彬,欧阳明,张莎莎. 食品科学. 2010(11)
博士论文
[1]水稻糊化温度特性的理化基础与分子遗传学研究[D]. 舒小丽.浙江大学 2006
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻淀粉合成相关的SSIIIα与PPDK的定点突变研究[D]. 吴清清.上海师范大学 2019
[2]普通水稻淀粉结构和功能特性研究[D]. 蔡金文.扬州大学 2015
[3]转基因技术改良稻米直链淀粉含量的研究[D]. 于恒秀.扬州大学 2002
本文编号：3118553
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
单靶点U6a-T-gRNA表达盒构建和扩增模式图
上海师范大学硕士学位论文材料与方法13③回收纯化U6a-T-gRNA表达盒对U6a-T-gRNA表达盒的克隆产物进行电泳分析，对约600bp位置的电泳条带进行切胶回收纯化（本实验胶回收均使用康为世纪公司的胶回收试剂盒），然后以B1/BL为引物进行扩增并送公司测序验证，验证正确的U6a-T-gRNA表达盒放置于-20℃保存备用。④连接MH终载同样采用边切边连的方法将gRNA表达盒连入MH最终载体。以上一步验证正确的U6a-T-gRNA表达盒纯化产物作为原料，反应体系和反应条件如下：U6a-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图如下：图2-3单靶点U6a-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图（3）双靶点质粒载体构建构建双靶点载体的过程也分为构建、扩增、回收纯化gRNA表达盒以及连接MH终载。构建双靶点gRNA表达盒时，分别将第一个和第二个靶点接头引物与U6a质粒和U6b质粒连接构成U6a-T-gRNA表达盒和U6b-T-gRNA表达盒。反应体MH质粒2μlU6a-T-gRNA4μlBsaⅠ1μlBsaⅠbuffer1μlT4连接酶1μlT4buffer3μlddH2O3μl总体积15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反应条件15个循环
上海师范大学硕士学位论文材料与方法15构建并扩增U6a-T-gRNA与U6b-T-gRNA表达盒的模式图如下：图2-4双靶点U6a-T-gRNA与U6b-T-gRNA表达盒构建和扩增模式图对第二轮克隆产物进行电泳，带长为600bp左右的是U6a-T-gRNA表达盒，U6b-T-gRNA表达盒电泳带长为500bp左右，分别切胶回收纯化。然后分别以引物B1/B2扩增U6a-T-gRNA表达盒纯化产物，以引物B2’/BL扩增U6b-T-gRNA表达盒纯化产物，并测序验证。构建双靶点MH终载时，将测序验证后的U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表达盒混合在一起通过边切边连的方法连接到MH终载质粒上。反应体系和反应条件如下：U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表达盒连接MH终载模式图如下：MH质粒4μlU6a-T-gRNA3μlU6b-T-gRNA3μlBsaⅠ0.5μlBsaⅠbuffer1.5μlT4连接酶0.5μlT4buffer2.5μl总体积15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反应条件15个循环
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系[J]. 白建江,张建明,朴钟泽,方军,李刚燮,王亚,杨瑞芳. 分子植物育种. 2018(05)
[2]转基因技术改良水稻淀粉品质研究进展[J]. 丁一,丁箐雯,李冰清,沈易,张宁,吴殿星. 中国稻米. 2018(01)
[3]CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因[J]. 汪秉琨,张慧,洪汝科,张锦文,杨睿,罗琼,曾千春. 中国水稻科学. 2018(01)
[4]CRISPR/Cas9系统:基因组定点编辑技术及其在植物基因功能研究中的应用[J]. 包爱科,白天惠,赵天璇,苏家豪. 草业学报. 2017(07)
[5]水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展[J]. 陈雅玲,包劲松. 中国水稻科学. 2017(01)
[6]水稻种子淀粉合成及其调控研究进展[J]. 彭波,庞瑞华,孙艳芳,李慧龙,宋晓华,周棋赢,宋世枝,李梁浩,江毅丹,袁红雨. 江西农业学报. 2016(06)
[7]CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展[J]. 陈伟潘. 南方农业. 2015(03)
[8]高温对水稻胚乳淀粉合成关键酶活性及内源激素含量的影响[J]. 张桂莲,廖斌,武小金,肖应辉,肖浪涛,陈立云. 植物生理学报. 2014(12)
[9]胚乳中淀粉的合成[J]. 刘德瑞,蔡秀玲. 植物生理学报. 2011(11)
[10]直链淀粉和支链淀粉的表征[J]. 李海普,李彬,欧阳明,张莎莎. 食品科学. 2010(11)
博士论文
[1]水稻糊化温度特性的理化基础与分子遗传学研究[D]. 舒小丽.浙江大学 2006
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻淀粉合成相关的SSIIIα与PPDK的定点突变研究[D]. 吴清清.上海师范大学 2019
[2]普通水稻淀粉结构和功能特性研究[D]. 蔡金文.扬州大学 2015
[3]转基因技术改良稻米直链淀粉含量的研究[D]. 于恒秀.扬州大学 2002
本文编号：3118553
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