千层塔内生真菌生物合成石杉碱甲的表观遗传调控基因研究
发布时间：2021-04-11 11:22
石杉碱甲（Huperzine A,Hup A）是一种高效中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂,可应用于轻中度阿尔茨海默病的治疗。石杉科植物如千层塔是石杉碱甲的主要天然来源,但是由于资源短缺,组织培养难度过大,人工合成步骤繁琐及高成本限制了石杉碱甲产业的发展。植物内生真菌因其生长周期短、易于培养且低成本等优点,渐渐成为了研究植物次生代谢产物合成的热点,为HupA生物合成研究提供了新思路。随着近年来表观遗传学研究的发展,表观调控在真菌研究领域显示出巨大潜力。表观遗传学指染色体DNA序列不发生改变的情况下,基因表达发生了可遗传的变化,从分子机制角度来看表观遗传调控是由环境因素引起的生物细胞内遗传物质发生了化学结构修饰,主要包括DNA甲基化,组蛋白修饰,RNA干扰等几个方面,这些调节模式极易受到环境的影响。HupA作为胶包炭疽次生代谢产物,其产量的积累受环境因素所调控,因此研究表观遗传对胶包炭疽合成HupA影响并阐释产量积累的分子机制具有重要的科学意义。目前对真菌的表观研究手段主要是通过基因工程敲除或过表达相关表观修饰基因,或者利用小分子表观遗传试剂两个方面。本课题组在前期工作中从千层塔中分离出具有产Hup...
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
石杉碱甲的化学结构式
湖南农业大学硕士学位论文6图1-2石杉碱甲生物合成推测途径Fig.1-2ProposedbiosyntheticpathwayofHupA1.2.4植物内生真菌植物内生真菌(Endophyticfungi)指部分或整个部生活史存活于健康植物组织体内，且对宿主植物无（或暂时）致病性的一类真菌[52]。主要分布于植物根、茎、叶、等器官、组织，极具丰富的生物多样性。它们是与植物组织处于互惠共利或互不影响状态的共生真菌，也包括潜伏的病原微生物[53]。内生真菌的研究始于19世纪末，至今已有100多年的历史，研究范围也仅限于小麦等重要的经济植物中[9]。直到1993Stierle从药用植物太平洋短叶红豆杉韧皮部中分离到1株能产紫杉醇的内生真菌Taxomycesandreanae以来[54]，人们认识到药用植物中内生真菌具备产生与宿主植物相同或类似药用活性成分的潜力，为解决珍稀濒危药用植物资源保护和可持续利用提供了新的研究思路。这可能是内生真菌与寄主植物通过长期的协同进化得来的，内生真菌与药用植物共生过程牵涉细胞形态形成、
第1章前言9饰，如构巢曲霉中敲除编码H3K4基因CclA后H3K4甲基化水平显著降低，并伴随着H3K9的甲基化水平下降，结果激活了至少2条沉默基因簇的表达以及8种新化合物的产生，可大大提高遗传稳定性[16]。开展内生真菌中石杉碱甲的表观遗传调控机制研究，对利用合成生物学技术改造和优化天然表达体系，或者在异源宿主中重建生物合成途径，构建石杉碱甲高产菌株具有重大意义。图1-3染色质基本结构单位—核小体Fig.1-3TheBasicStructuralUnitofChromatin—Nucleosome1.3研究内容和技术路线(1)本研究以从千层塔中分离出具有产HupA能力的内生真菌胶胞炭疽为研究对象，通过在内生真菌发酵过程中添加两种小分子表观遗传抑制剂，分别是DNA甲基转移酶抑制剂—5-杂氮胞苷（5-Azacytidine，5-AC）；组蛋白去乙酰化酶抑制剂—丙戊酸钠（SodiumValproate，SV）、烟酰胺（Nicotinamide，NIC）、丁酸钠（Sodiumbutyrate，SB）、曲古柳菌素（TrichostatinA，TSA）探究对Cg01生物量及合成HupA的影响。验证表观遗传修饰具有调控内生真菌胶胞炭疽合成HupA作用，为结合前期工作筛选候选基因提供基矗(2)采取PEG介导的同源重组转化法，对筛选获得的4个表观遗传相关候选基因（Cg-HAT-09571、Cg-HMT-13874、Cg-HDAC-15620、Cg-HAT-02312）进行敲除与回补，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲产量。(3)通过染色质免疫共沉淀联合高通量测序（Chip-seq）试验获得Cg-HMT-13874基因敲除突变体关联基因。(4)通过RNA-seq探究关联基因转录水平并联合Chip-seq分析得到影响Cg01合成HupA的关键基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]药用植物内生真菌研究现状和发展趋势[J]. 郭顺星. 菌物学报. 2018(01)
[2]中药有效成分石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的研究进展[J]. 李琳,杜岩. 实用老年医学. 2017(07)
[3]丝状真菌在纤维素酶合成过程中碳源代谢调控的研究进展[J]. 董妙音,王曙阳,王雨辰,许富强,李文建,陈积红,刘敬,胡伟. 中国酿造. 2016(10)
[4]抗阿尔茨海默病药物临床研究进展[J]. 彭英,李萍萍,李琳,张喻,侯伟贞,崔丹丹,李江,王玲,王庆利,王晓良. 药学学报. 2016(08)
[5]血浆多巴胺β羟化酶与阿尔茨海默病相关性研究[J]. 孟云,朱言亮. 中国实验诊断学. 2015(09)
[6]化学表观遗传修饰方法在真菌次级代谢产物研究中的应用[J]. 张伟,陈敏,邵长伦,王长云. 中国海洋药物. 2014(05)
[7]石杉碱甲的合成研究进展[J]. 郑书岩,郁春辉,沈征武. 有机化学. 2013(11)
[8]药用植物金银花的研究现状与发展趋势探讨[J]. 方利娟. 宁夏农林科技. 2013(05)
[9]药用裸子植物内生真菌研究现状与展望[J]. 解修超,陈文强,邓百万,彭浩,张晓伟,张曼. 江苏农业科学. 2013(02)
[10]高效液相色谱法定量测定中药千层塔提取物中的石杉碱甲[J]. 张敬彩,魏杰,钟虹敏,郭志谋,张华. 色谱. 2013(01)
博士论文
[1]遗传、基因和进化[D]. 陆俏颖.中山大学 2016
[2]从肺论治AD的理论探讨及补肺宣肺通腑降浊方治疗AD的实验研究[D]. 魏录翠.湖南中医药大学 2009
硕士论文
[1]组蛋白修饰对里氏木霉纤维素酶表达的初步研究[D]. 周娇娇.深圳大学 2017
[2]cre4基因在里氏木霉中对纤维素酶表达的调控研究[D]. 刘雯莉.深圳大学 2016
[3]化学表观遗传修饰法研究海葵来源月状旋孢腔菌代谢产物多样性初探[D]. 张伟.中国海洋大学 2014
[4]内侧隔核注射淀粉样β蛋白对大鼠认知功能的影响及其机制研究[D]. 孔林林.山西医科大学 2013
[5]曼地亚红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离鉴定[D]. 郭俊柯.西北农林科技大学 2012
[6]千层塔组织培养体系的建立及激素对丛生苗生长和石杉碱甲合成的影响[D]. 梁昊.合肥工业大学 2010
[7]琥珀八氢氨吖啶对胆碱酯酶的抑制研究[D]. 杨会.吉林大学 2007
本文编号：3131164
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
石杉碱甲的化学结构式
湖南农业大学硕士学位论文6图1-2石杉碱甲生物合成推测途径Fig.1-2ProposedbiosyntheticpathwayofHupA1.2.4植物内生真菌植物内生真菌(Endophyticfungi)指部分或整个部生活史存活于健康植物组织体内，且对宿主植物无（或暂时）致病性的一类真菌[52]。主要分布于植物根、茎、叶、等器官、组织，极具丰富的生物多样性。它们是与植物组织处于互惠共利或互不影响状态的共生真菌，也包括潜伏的病原微生物[53]。内生真菌的研究始于19世纪末，至今已有100多年的历史，研究范围也仅限于小麦等重要的经济植物中[9]。直到1993Stierle从药用植物太平洋短叶红豆杉韧皮部中分离到1株能产紫杉醇的内生真菌Taxomycesandreanae以来[54]，人们认识到药用植物中内生真菌具备产生与宿主植物相同或类似药用活性成分的潜力，为解决珍稀濒危药用植物资源保护和可持续利用提供了新的研究思路。这可能是内生真菌与寄主植物通过长期的协同进化得来的，内生真菌与药用植物共生过程牵涉细胞形态形成、
第1章前言9饰，如构巢曲霉中敲除编码H3K4基因CclA后H3K4甲基化水平显著降低，并伴随着H3K9的甲基化水平下降，结果激活了至少2条沉默基因簇的表达以及8种新化合物的产生，可大大提高遗传稳定性[16]。开展内生真菌中石杉碱甲的表观遗传调控机制研究，对利用合成生物学技术改造和优化天然表达体系，或者在异源宿主中重建生物合成途径，构建石杉碱甲高产菌株具有重大意义。图1-3染色质基本结构单位—核小体Fig.1-3TheBasicStructuralUnitofChromatin—Nucleosome1.3研究内容和技术路线(1)本研究以从千层塔中分离出具有产HupA能力的内生真菌胶胞炭疽为研究对象，通过在内生真菌发酵过程中添加两种小分子表观遗传抑制剂，分别是DNA甲基转移酶抑制剂—5-杂氮胞苷（5-Azacytidine，5-AC）；组蛋白去乙酰化酶抑制剂—丙戊酸钠（SodiumValproate，SV）、烟酰胺（Nicotinamide，NIC）、丁酸钠（Sodiumbutyrate，SB）、曲古柳菌素（TrichostatinA，TSA）探究对Cg01生物量及合成HupA的影响。验证表观遗传修饰具有调控内生真菌胶胞炭疽合成HupA作用，为结合前期工作筛选候选基因提供基矗(2)采取PEG介导的同源重组转化法，对筛选获得的4个表观遗传相关候选基因（Cg-HAT-09571、Cg-HMT-13874、Cg-HDAC-15620、Cg-HAT-02312）进行敲除与回补，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲产量。(3)通过染色质免疫共沉淀联合高通量测序（Chip-seq）试验获得Cg-HMT-13874基因敲除突变体关联基因。(4)通过RNA-seq探究关联基因转录水平并联合Chip-seq分析得到影响Cg01合成HupA的关键基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]药用植物内生真菌研究现状和发展趋势[J]. 郭顺星. 菌物学报. 2018(01)
[2]中药有效成分石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的研究进展[J]. 李琳,杜岩. 实用老年医学. 2017(07)
[3]丝状真菌在纤维素酶合成过程中碳源代谢调控的研究进展[J]. 董妙音,王曙阳,王雨辰,许富强,李文建,陈积红,刘敬,胡伟. 中国酿造. 2016(10)
[4]抗阿尔茨海默病药物临床研究进展[J]. 彭英,李萍萍,李琳,张喻,侯伟贞,崔丹丹,李江,王玲,王庆利,王晓良. 药学学报. 2016(08)
[5]血浆多巴胺β羟化酶与阿尔茨海默病相关性研究[J]. 孟云,朱言亮. 中国实验诊断学. 2015(09)
[6]化学表观遗传修饰方法在真菌次级代谢产物研究中的应用[J]. 张伟,陈敏,邵长伦,王长云. 中国海洋药物. 2014(05)
[7]石杉碱甲的合成研究进展[J]. 郑书岩,郁春辉,沈征武. 有机化学. 2013(11)
[8]药用植物金银花的研究现状与发展趋势探讨[J]. 方利娟. 宁夏农林科技. 2013(05)
[9]药用裸子植物内生真菌研究现状与展望[J]. 解修超,陈文强,邓百万,彭浩,张晓伟,张曼. 江苏农业科学. 2013(02)
[10]高效液相色谱法定量测定中药千层塔提取物中的石杉碱甲[J]. 张敬彩,魏杰,钟虹敏,郭志谋,张华. 色谱. 2013(01)
博士论文
[1]遗传、基因和进化[D]. 陆俏颖.中山大学 2016
[2]从肺论治AD的理论探讨及补肺宣肺通腑降浊方治疗AD的实验研究[D]. 魏录翠.湖南中医药大学 2009
硕士论文
[1]组蛋白修饰对里氏木霉纤维素酶表达的初步研究[D]. 周娇娇.深圳大学 2017
[2]cre4基因在里氏木霉中对纤维素酶表达的调控研究[D]. 刘雯莉.深圳大学 2016
[3]化学表观遗传修饰法研究海葵来源月状旋孢腔菌代谢产物多样性初探[D]. 张伟.中国海洋大学 2014
[4]内侧隔核注射淀粉样β蛋白对大鼠认知功能的影响及其机制研究[D]. 孔林林.山西医科大学 2013
[5]曼地亚红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离鉴定[D]. 郭俊柯.西北农林科技大学 2012
[6]千层塔组织培养体系的建立及激素对丛生苗生长和石杉碱甲合成的影响[D]. 梁昊.合肥工业大学 2010
[7]琥珀八氢氨吖啶对胆碱酯酶的抑制研究[D]. 杨会.吉林大学 2007
本文编号：3131164
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