苏云金芽胞杆菌HD12菌株中cry基因的表达调控

发布时间：2017-04-17 11:23

  本文关键词：苏云金芽胞杆菌HD12菌株中cry基因的表达调控，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性细菌。其在形成芽胞的同时会产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体,主要由cry和cyt基因编码。在目前的应用中,Bt菌剂存在着毒力有限、杀虫谱较专一、害虫容易产生抗性等问题。在遗传工程菌的构建过程中,多种杀虫基因的协同表达十分重要。本实验室B.thuringiensis subsp.morrisoni strain HD12菌株含有多个杀虫蛋白,主要对鳞翅目害虫具有毒性,前期的二代测序获得基因组序列,分析其发现含有8个cry基因,符合多基因表达调控的研究。本研究利用蔗糖梯度离心法纯化HD12菌株晶体蛋白,通过SDS-PAGE和LC-MS/MS对晶体蛋白进行鉴定,确定HD12晶体中含有Cry1Da、Cry1Ae、Cry1Bb、Cry1Fb、Cry1Ja五个蛋白。同时通过在不同遗传背景的菌株中检测cry1Da、cry1Ae、cry1Bb、cry1Fb、cry1Ja启动子的β-半乳糖苷酶活性,确定cry1Da基因的转录是受SigE控制,其它的四个基因的转录是受SigE、SigK控制。其中cry1Ja和cry1Fb基因启动子活性是最高的。选取cry1Ja和cry1Fb基因启动子来分别指导Cry1Ac和Cry2Ab蛋白表达。通过SDS-PAGE分析和质谱鉴定确定cry1Ja、cry1Fb基因启动子均可指导Cry1Ac、Cry2Ab蛋白正确表达。成功构建了具有相同转录机制的两个不同的启动子指导多个外源cry基因的表达菌株。本研究确定了相同转录机制的启动子能够直接指导不同的cry基因在一个菌株中表达。这对克服当前Bt杀虫剂应用限制,构建多基因表达的菌株具有重要价值。为Bt菌株中表达多种依赖相同调控机制的cry基因提供了新思路。
【关键词】：苏云金芽胞杆菌 cry基因 cry基因启动子 表达菌株
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩略表7-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介10
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其形成过程10-11
• 1.3 cry基因的表达调控11-15
• 1.3.1 转录水平的调控11-13
• 1.3.2 转录后水平的调控13-15
• 1.3.3 翻译水平15
• 1.4 Cry蛋白的增效15-16
• 1.5 高效启动子在工程菌构建中的应用16-17
• 1.6 研究目的与意义17-18
• 第二章 HD12菌株生物信息学分析及晶体蛋白纯化18-22
• 2.1 材料与方法18-20
• 2.1.1 供试菌株18
• 2.1.2 主要试剂和仪器18-19
• 2.1.3 培养基19
• 2.1.4 试验方法19-20
• 2.2 结果与分析20-21
• 2.3 小结21-22
• 第三章 HD12菌株cry基因转录调控机制分析22-56
• 3.1 材料与方法22-33
• 3.1.1 供试菌株和质粒22-23
• 3.1.2 主要试剂和仪器23-25
• 3.1.3 培养基25
• 3.1.4 引物序列25-26
• 3.1.5 试验方法26-33
• 3.2 结果与分析33-53
• 3.2.1 cry1Da基因转录机制分析33-36
• 3.2.2 cry1Ae基因转录机制分析36-39
• 3.2.3 cry1Bb基因转录机制分析39-43
• 3.2.4 cry1Fb基因转录机制分析43-46
• 3.2.5 cry1Ja基因转录机制分析46-49
• 3.2.6 cry基因启动子序列及活性比对分析49-53
• 3.3 小结53-56
• 第四章 HD12菌株强启动子启动异源基因表达56-68
• 4.1 材料与方法56-59
• 4.1.1 供试菌株和质粒56-57
• 4.1.2 主要试剂和仪器57
• 4.1.3 培养基57
• 4.1.4 引物序列57-58
• 4.1.5 试验方法58-59
• 4.2 结果与分析59-65
• 4.2.1 pHT315-P1Ja-1Ac与pHT315-P1Fb-1Ac表达载体的构建59-60
• 4.2.2 pHT1618-P1Ja-2Ab与pHT1618-P1Fb-2Ab表达载体的构建60-62
• 4.2.3 cry1Ja、cry1Fb基因启动子启动Cry1Ac、Cry2Ab表达的重组菌株构建62
• 4.2.4 cry1Ja、cry1Fb基因启动子启动Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表达分析62-63
• 4.2.5 cry1Ja、cry1Fb基因启动子启动Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表达菌株质谱鉴定63-65
• 4.3 小结65-68
• 第五章 讨论与结论68-72
• 5.1 讨论68-69
• 5.1.1 HD12菌株中cry基因转录调控机制分析68
• 5.1.2 不同启动子启动Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表达产量分析68-69
• 5.2 结论69-72
• 参考文献72-80
• 致谢80-82
• 个人简历82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 彭琦;周子珊;张杰;;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展[J];中国生物防治学报;2015年05期

2 郑庆云;王冠男;张U

本文编号：313127