一株嗜酸性霉菌的鉴定及其α-淀粉酶和甘露聚糖酶基因的克隆与表达

发布时间：2021-04-14 12:14

　　黑曲霉是一种重要的工业发酵菌,生长迅速,发酵周期短,且生长过程中不受杂菌的污染及不产毒素的特点,为符合美国FDA之GRAS公认安全菌株,产酶种类多,产酶能力强,一些极端酶大部分来自于曲霉,由此更加奠定了其在发酵工业上的地位。耐酸性α-淀粉酶可补足常用淀粉酶在低pH条件下性能不足的短板,在提高工业生产废品的利用和处理、降低原料消耗等方面具有很大的应用潜力与开发前景,甘露聚糖酶是一种新型的工业化生产酶,但是由于其发酵酶活低而导致其成本高,限制了应用范围,因此,对该酶的研究具有一定的价值。本实验从新疆某铀矿酸性浸出液分离得到一株霉菌,本实验中命名为MJ 5。根据形态学特征、rDNA ITS序列分析以及Biolog鉴定系统对该菌株进行鉴定,同时Biolog鉴定板可提供菌株对碳源的消耗情况,由此可分析了解该菌的生长情况及优势碳源。通过对菌株的粗酶液测定α淀粉酶酶活,根据全基因组测序结果,设计引物获得耐酸性α淀粉酶和甘露聚糖酶基因的序列片段,与pPIC9K构建表达载体,导入酵母受体细胞进行表达,结果表明:（1）结合三种鉴定系统鉴定霉菌MJ 5为黑曲霉Aspergillus niger,霉菌的最适碳... 

【文章来源】：东华理工大学江西省

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黑曲霉
        1.1.1 黑曲霉简介
        1.1.2 黑曲霉的工业应用
            1.1.2.1 黑曲霉在柠檬酸生产中的应用
            1.1.2.2 黑曲霉表达系统以及酶制剂生产中的应用
            1.1.2.3 黑曲霉在冶金领域的应用
            1.1.2.4 黑曲霉在养殖业上的应用
    1.2 耐酸性α-淀粉酶
        1.2.1 耐酸性α-淀粉酶的来源
        1.2.2 耐酸性α-淀粉酶的催化机制
        1.2.3 α-淀粉酶的特性及作用机制
        1.2.4 耐酸性α-淀粉酶的耐酸机制及耐热性
        1.2.5 α-淀粉酶的酶活测定方法
        1.2.6 耐酸性α-淀粉酶的应用
        1.2.7 耐酸性α-淀粉酶的异源表达
        1.2.8 耐酸性α-淀粉酶的开发和应用概况
    1.3 甘露聚糖酶
        1.3.1 β-甘露聚糖酶的来源
        1.3.2 β-甘露聚糖酶的酶学性质
        1.3.3 β-甘露聚糖酶的异源表达
        1.3.4 国内外研究进展
        1.3.5 β-甘露聚糖酶的应用
    1.4 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统[95]
        1.4.1 毕赤酵母表达系统研究现状
        1.4.2 毕赤酵母表达系统的优点
        1.4.3 影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素
        1.4.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用
    1.5 真菌ITS序列分析与Biolog微生物鉴定系统
    1.6 研究内容、目的与意义
第二章 嗜酸性霉菌MJ5的鉴定、碳源分析及所产α淀粉酶的酶学性质
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和试剂
        2.1.2 培养基
    2.2 引物合成及测序
    2.3 实验仪器
    2.4 实验方法
        2.4.1 菌株的分离、纯化与保存
        2.4.2 菌体的形态学观察
        2.4.3 rDNAITS序列以及进化树的构建
        2.4.4 Biolog微生物鉴定系统
        2.4.5 在不同培养基下MJ5的产酸情况
        2.4.6 MJ5淀粉酶性质的研究
            2.4.6.1 淀粉酶酶活标准曲线的测定
            2.4.6.2 淀粉酶的酶活力测定
            2.4.6.3 MJ5淀粉酶产酶曲线的绘制
            2.4.6.3 MJ5胞外淀粉酶的最适反应温度
            2.4.6.4 MJ5胞外淀粉酶最适反应pH
            2.4.6.5 MJ5胞外淀粉酶pH稳定性和温度稳定性的测定
    2.5 结果与分析
        2.5.1 MJ5的形态特征观察
        2.5.2 rDNAITS序列鉴定结果
        2.5.3 碳源代谢分析
        2.5.4 不同培养基下的产酸情况
        2.5.5 葡萄糖标准曲线的绘制
        2.5.6 MJ5淀粉酶的产酶曲线
        2.5.7 MJ5淀粉酶的最适温度
        2.5.8 MJ5淀粉酶的最适pH
        2.5.9 MJ5淀粉酶pH稳定性
        2.5.10 MJ5淀粉酶的热稳定性
    2.6 讨论
    2.7 小结
第三章 黑曲霉MJ5（AspergillusnigerMJ5）耐酸性α-淀粉酶基因的克隆与表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株、载体、工具酶和试剂
        3.1.2 引物合成及测序
        3.1.3 培养基及试剂的配制
        3.1.4 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 黑曲霉MJ5全基因组测序
        3.2.2 耐酸性α-淀粉酶基因的克隆
        3.2.3 耐酸性α-淀粉酶基因cDNA全长序列
        3.2.4 耐酸性α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达
    3.3 结果与分析
        3.3.1 黑曲霉MJ5全基因组测序结果
        3.3.2 AspergillusnigerMJ5耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5的扩增
        3.3.3 重组表达载体的构建与阳性克隆菌落的鉴定结果
        3.3.4 耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5基因序列分析
        3.3.5 耐酸性α-淀粉酶基因编码蛋白序列的糖基化分析
        3.3.6 耐酸性α-淀粉酶基因基因所编码蛋白的等电点和分子量预测
        3.3.7 重组质粒的线性化与α-amy-5重组菌株的筛选
        3.3.8 重组淀粉酶酶活测定结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 黑曲霉MJ5（AspergillusnigerMJ5）甘露聚糖酶基因的克隆与表达
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株、载体、工具酶和试剂
        4.1.2 引物合成及测序
        4.1.3 培养基及试剂的配制
        4.1.4 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 MJ5甘露聚糖酶基因的克隆
        4.2.2 甘露聚糖酶基因cDNA全长序列
        4.2.3 MJ5甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达
        4.2.4 重组甘露聚糖酶的酶学性质测定
            4.2.4.1 甘露聚糖酶酶活标准曲线的测定
            4.2.4.2 甘露聚糖酶的酶活力以及比活力的测定
            4.2.4.3 MJ5甘露聚糖酶的最适反应温度
    4.3 结果与分析
        4.3.1 AspergillusnigerMJ5甘露聚糖酶基因man-5的扩增
        4.3.2 重组表达载体的构建与阳性克隆菌落的鉴定结果
        4.3.3 MJ5甘露聚糖酶基因man-5基因序列分析
        4.3.4 MJ5甘露聚糖酶基因编码蛋白序列的糖基化分析
        4.3.5 MJ5甘露聚糖酶基因基因所编码蛋白的等电点和分子量预测
        4.3.6 重组质粒的线性化与man-5重组菌株的筛选
        4.3.7 MJ5甘露聚糖酶man-5的纯化及脱糖基化
        4.3.8 MJ5甘露聚糖酶man-5的酶学性质分析
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
作者攻读学位期间的科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]一株分离自铀矿酸性浸出液霉菌的鉴定与碳源代谢分析[J]. 刘欢,徐玲玲,李江.  生物技术通报. 2018(04)
[2]基于Biolog-FF技术的金霉素降解真菌的碳代谢特征研究[J]. 张惠艳,李艳菊,顾金刚,董晓霞,尚攀.  微生物学通报. 2015(07)
[3]α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展[J]. 封棣,孟青青,王玉海,杨慧敏,杨建国,王风寰.  食品工业科技. 2014(15)
[4]热击对黑曲霉孢子萌发及产木聚糖酶的影响[J]. 刘新育,王一凡,王明道,陈红歌.  食品与发酵工业. 2013(11)
[5]1株蒜薹采后病原真菌的鉴定、rDNA ITS序列及碳源代谢指纹图谱分析[J]. 王友升,何欣萌,张燕,张萌,李健,李丽萍.  食品科学. 2013(15)
[6]Biolog微生物鉴定系统在丝状真菌鉴定碳源同化方面的应用[J]. 张志华.  安徽农业科学. 2013(02)
[7]Thermococcus siculi HJ21 α-淀粉酶Asp186定点突变对酶活性的影响[J]. 吕明生,杨帆,胡建恩,房耀维,焦豫良,王淑军,刘姝.  食品科学. 2012(11)
[8]黑曲霉产有机酸浸出铀矿石的影响因素[J]. 王永东,李广悦,丁德馨,胡南,邓钦文,周支香.  化工学报. 2012(05)
[9]产甘露聚糖酶菌株的筛选·鉴定及酶活性的初步研究[J]. 武玉永,于敏,武芝.  安徽农业科学. 2012(08)
[10]氯化锂诱变黑曲霉原生质体选育高产植酸酶菌株[J]. 李文,王陶,李同祥.  食品与发酵工业. 2012(02)

博士论文
[1]油脂酵母高效处理丁醇发酵废水机理与集总动力学研究[D]. 熊莲.华南理工大学 2015
[2]浸铀异养微生物的筛选及黑曲霉浸铀机理研究[D]. 王永东.南华大学 2014
[3]米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鉴定与异源表达[D]. 李松.江南大学 2011

硕士论文
[1]黑曲霉AS3.350基因组分析和转录组表达研究[D]. 周峰.华南理工大学 2015
[2]新型真菌淀粉水解酶及其功能研究[D]. 华慧芳.中国农业科学院 2015
[3]耐高温α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 许婧.四川农业大学 2013
[4]黑曲霉（AS3.316）产纤维素酶条件优化及重离子辐照诱变高产菌株筛选[D]. 唐嘉徽.甘肃农业大学 2012
[5]里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究[D]. 高星星.合肥工业大学 2012
[6]高效生物絮凝菌筛选及絮体特征研究[D]. 李珊.东华大学 2012
[7]脂环酸芽孢杆菌产耐酸耐高温淀粉酶及酶学性质研究[D]. 盛嘉元.南京理工大学 2009
[8]微生物发酵生产耐酸性α-淀粉酶的研究[D]. 李勃.西北大学 2009
[9]来源于枯草芽孢杆菌的中温α-淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达[D]. 杨雅婷.山东师范大学 2007
[10]产耐酸性α-淀粉酶菌株的选育及发酵条件的初步研究[D]. 杨培华.中南林业科技大学 2006



本文编号：3137300