等温核酸免标记荧光信号放大策略在基因检测中的应用

发布时间：2021-04-18 20:51

　　特定核酸或基因序列的检测在临床诊断,基因突变,生物防卫等领域有着至关重要的应用价值。近年来,研究者一直致力于发展更灵敏和简便的生物传感器技术用于特定核酸的检测。其中,荧光生物传感器具有操作简单、选择性好、响应快速等优点而成为重要的研究方向。然而,目前的荧光生物传感器技术大多需要标记和借助纳米材料来达到进行信号放大的目的。本研究设计了三种无需标记和纳米材料就能实现信号扩增的荧光生物传感器,并对其可行性、工作条件和性能开展了详细地研究,为开发出灵敏度高、操作简单和成本低廉的荧光生物传感器具有重要的参考价值。主要结果如下:1.基于核酸外切酶III（Exo III）介导的级联荧光信号放大策略,构建了一种无需标记的荧光生物传感器,实现了对金黄色葡萄球菌mecA基因的高灵敏度和操作简便的检测。该设计中发夹探针（hairpine probe,HP）作为识别元件和信号报告元件,行使着目标序列识别和信号报告的功能;当mecA目标基因不存在时,HP不能被Exo III消化,因而富含G的核酸序列被限制在HP探针的茎端;当存在mecA基因时,会与HP互补杂交形成3’为平末端的双链,引起Exo III的消化反应... 

【文章来源】：湖南农业大学湖南省

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【图文】：

SGI的分子结构图

第一章文献综述3图1.1SGI的分子结构图Fig.1.1MolecularstructureofSGIChen等人报道了一种以SGI为信号的免标记检测双酚A的等温信号放大的荧光技术[21]。原理如图1.2所示，当没有目标物存在时，双链DNA1/DNA2、发夹探针A、B和C都会被核酸外切酶III（ExoIII）水解，形成ssDNA和单个碱基的碎片。当加入目标物后，DNA1与目标物特异性结合，DNA1中引发链置换反应的引发链片段被暴露出来。然后引发链与发夹探针A结合，接着再与发夹探针B结合，最后与发夹探针C结合，形成3’突出末端的dsDNA，同时释放出引发链。被释放的引发链与剩下的发夹探针A、B和C开始新一轮的链置换反应，最终体系中存在大量dsDNA。加入SGI染料，体系就会产生显著的荧光信号。因而就可以实现对目标物进行高灵敏度的检测分析，该体系的检测限低至5fM。利用SGI为信号的方法还被用于microRNA、ATP、T4PNK和Hg2+的检测[22-25]。图1.2SYRBGreenI为信号检测双酚A的原理图Fig.1.2SchematicrepresentationofamplifiedfluorescencebisphenolAdetectionusingSYRBGreenIasthesignalreporter

湖南农业大学硕士学位论文4G-四联体（G-quadruplex）是由富含鸟嘌呤的核酸序列构成的四链DNA纳米结构[26]。在K+、NH4+等阳离子的介导下，富含鸟嘌呤的DNA链可以折叠形成G-四联体结构[27]。一些荧光染料可以与G-四联体结构结合，产生强烈的荧光信号，从而实现对目标物的分析检测。这些染料包括N-甲基卟啉二丙酸IX（NMM），四（二异丙基胍基）酞氰锌（Zn-DIGP）、硫黄素T（ThioflavinT，ThT）和原卟啉（PPIX）等。NMM是一种常用的能与G-四联体结合的荧光染料，分子结构如图1.3所示。当NMM处于游离状态时，荧光信号十分微弱；当存在G-四联体结构时，NMM能与G-四联体结合，然后产生十分显著的荧光信号[28]。NMM对单链、双链和三链都不会产生特异性结合反应[29]。图1.3NMM的分子结构图Fig.1.3MolecularstructureofNMMLi等人报道了一种以G-四联体为信号的免标记检测三磷酸腺苷的等温信号放大的荧光技术[30]。原理如图1.4所示，当没有ATP存在时，体系无法发生链置换反应，含有G-四联体的核酸链被牢牢的绑住，导致体系中荧光信号很弱。但加入ATP之后，ATP与三链DNA复合探针中的ATP适配体结合，使得该复合探针的构型发生变化，并导致支点区域的暴露，燃料DNA随后杂交到该区域上，通过支点介导的链置换反应释放出G-四联体序列和ATP。被释放的ATP可以循环再利用，使得体系中产生大量的G-四联体序列。这些G-四联体序列能与NMM结合产生显著的荧光信号。因而就可以实现对目标物进行高灵敏度的检测分析，该体系的检测限低至25nM。利用G-四联体为报告信号的方法还被用于DNA、KF聚合酶、生物硫醇和Ag+的检测[31-34]。

【参考文献】：
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本文编号：3146155