利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

发布时间：2021-04-25 00:38

　　目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C）基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,构建真核重组表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果。最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响。结果筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础。 

【文章来源】：军事医学. 2017,41(05)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 细胞培养
        1.2.2 sgRNA的设计
        1.2.3 重组真核表达质粒p Sp Cas9-Cdc25C的构建
        1.2.4 Cdc25C基因敲除稳定细胞株的筛选
        1.2.5 提取细胞基因组DNA并对目标片段进行测序
        1.2.6 稳定细胞株的免疫印迹检测
        1.2.7 细胞周期的检测
2 结果
    2.1 重组表达载体p Sp Cas9-Cdc25C的构建与鉴定
    2.2 免疫印迹筛选Cdc25C基因敲除细胞株克隆
    2.3 测序验证Cdc25C的敲除效果
    2.4 Cdc25C基因敲除细胞株稳定性的检测
    2.5 Cdc25C基因敲除细胞株的周期进程检测
3 讨论



本文编号：3158363