KR3和Hs1基因聚合对大豆花叶病毒病抗性的影响

发布时间：2017-04-19 12:06

  本文关键词：KR3和Hs1基因聚合对大豆花叶病毒病抗性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物。大豆花叶病毒病分布十分广泛不仅是一种世界性病害,而且也是南方地区常见的大豆病害之一。大豆花叶病毒在大豆种植过程都会危害大豆,不仅影响大豆产量,还会影响大豆质量,会造成病株籽粒出现褐斑,严重降低大豆商品质量。花叶病毒防治常采用种植抗性品种,但抗性品种的选育是一个长期过程且品种抗性会随着花叶病毒生理小种的改变而丧失。利用基因工程技术在植物基因组中导入植物抗病基因是植物抗病毒病育种中一条十分有效的途径。植物中抗病基因在受到病原物侵染时通过直接或间接地与病毒产物作用来识别病原体产生反应信号,从而启动植物体内的防御机制。KR3基因是大豆抗病基因,其编码的氨基酸序列在结构上与烟草抗花叶病毒N基因具有高度同源性,因此KR3基因可能具有抗花叶病毒的功能。KR3基因在结构上也存在NBS、LRR、TIR等抗病基因具备的保守结构,含有抗病基因的保守序列,是NBS-LRR-TIR类抗病基因。Hs1pro-1是从野生甜菜中克隆的第一个胞囊线虫抗性基因,是胞外富亮氨酸重复的跨膜蛋白和含有LRR保守序列。本实验利用分别连有KR3基因、Hs1pro-1基因的农杆菌为表达载体,bar基因作为选择标记基因,以天隆一号为受体,采用农杆菌介导子叶节转化法进行大豆遗传转化,共转化624个外植体,获得转基因生根苗38株；通过草丁膦涂抹法、bar试纸条检测法和PCR法鉴定,共获得25株T0代转基因阳性转化植株,其中转KR3基因阳性植株8株,转Hslpro-1基因17株,平均转化效率为3.89%,进一步对T1代6株独立的转基因植株进行Southern杂交检测,结果表明K1、H1和H3株系为单拷贝株系,其余为多拷贝株系；以获得的转KR3基因和转Hs1pro-1基因阳性植株为父母本,用传统的杂交方法对其进行杂交,共获得9粒F1代杂交种子,播种通过杂交获得的F1代杂交种子,1粒种子未能正常发芽,对其他F1代植株进行PCR鉴定,结果显示只有4号转基因植株成功杂交；ELISA检测结果表明,KR3、Hs1pro-1转基因植株及KR3-Hsl基因聚合植株对花叶病毒具有一定的抗性,且KR3-Hs1基因聚合植株SMV抗性要强于大部分转基因植株,而非转基因则明显感病。实时荧光定量PCR结果表明SMV接种前后转基因不同株系基因表达量存在差异,在转Hs1pro-1基因植株中,Hs1pro-1基因表达有所降低,而同时含KR3基因、Hs1Pro-1基因的聚合植株中KR3基因、Hs1pro-1基因表达均升高,说明两个抗病基因同时存在能够增强SMV抗性,根据防御基因PR1、PR3、OSM、EBF、ERF1、ERS2表达情况猜测在KR3-Hsl基因聚合植株中SA和JA/ET途径可能存在相互协同作用表现对SMV的抗性,而在KR3、Hs1pro-1转基因植株中抗病信号传导主要由SA途径完成；ELISA检测结果表明,SA处理增强了非转基因植株和转基因植株对大豆花叶病毒的抗性,且转基因植株的抗性比非转基因植株强。SA处理后接种SMV转基因大豆的荧光定量结果表明转基因不同株系KR3基因、Hs1Pro-1基因表达均有所降低,说明SA可能抑制了接种SMV转基因植株中KR3基因、Hs1pro-1基因的表达,由防御基因的表达推测SA处理后的抗SMV过程抗病信号传导主要由JA/ET途径完成。
【关键词】：大豆 抗病基因 KR3基因 Hs1~(pro-1)基因 大豆花叶病毒
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.651
【目录】：

• 致谢5-8
• 缩略图表8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 第一章 文献综述14-28
• 1 大豆花叶病毒研究进展14-16
• 1.1 大豆花叶病毒的分布与危害14-15
• 1.2 大豆花叶病毒的发病症状15
• 1.3 大豆花叶病毒的防治15-16
• 2 植物抗病基因研究进展16-24
• 2.1 植物抗病基因结构与分类19-21
• 2.1.1 胞囊线虫抗性基因Hs1~(pro-1)的发现21
• 2.1.2 大豆抗性基因KR3的克隆21
• 2.2 植物抗性反应21-24
• 2.2.1 早期识别21-22
• 2.2.2 信号组成22-23
• 2.2.3 防御相关蛋白23-24
• 2.2.4 SA在植物抗性反应中的作用24
• 3 基因工程在大豆抗病中的应用24-26
• 3.1 大豆抗病基因的克隆25
• 3.2 基因工程在大豆抗病育种的应用25-26
• 4 本研究的目的和意义26-28
• 第二章 KR3、Hs1~(pro-1)、KR3-Hs1~(pro-1)基因大豆植株的获得28-48
• 1 转KR3基因、Hs1~(pro-1)基因大豆植株的获得28-36
• 1.1 实验材料28-30
• 1.1.1 转化受体28
• 1.1.2 供试质粒和菌株28-29
• 1.1.3 试验试剂29-30
• 1.1.4 供试培养基30
• 1.2 实验方法30-36
• 1.2.1 农杆菌介导大豆子叶节转化法30-32
• 1.2.2 转KR3基因、Hs1~(pro-1)基因植株的鉴定32-36
• 2 KR3-Hs1~(pro-1)聚合植株的获得36-38
• 2.1 实验材料36
• 2.2 实验方法36-38
• 2.2.1 整体去雄杂交技术36-37
• 2.2.2 PCR法检测37-38
• 2.2.3 RT-PCR检测38
• 3 结果与分析38-44
• 3.1 农杆菌介导大豆子叶节转化体系的建立38-39
• 3.2 大豆遗传转化生根苗统计39
• 3.3 KR3基因和Hs1~(pro-1)基因转化植株鉴定结果39-42
• 3.4 T_0代转基因大豆遗传转化结果42
• 3.5 转基因杂交结果42-43
• 3.6 转基因杂交鉴定结果43-44
• 4 讨论44-48
• 4.1 农杆菌介导大豆子叶节转化法44-45
• 4.2 转基因植株鉴定方法的比较45-46
• 4.3 大豆转基因转化效率研究46
• 4.4 大豆杂交技术研究46-48
• 第三章 KR3、Hs1、KR3-Hs1转基因大豆花叶病毒抗性及防御基因表达48-64
• 1 材料与方法48-53
• 1.1 实验材料48-49
• 1.1.1 供试植株48
• 1.1.2 实验试剂48-49
• 1.2 实验方法49-53
• 1.2.1 花叶病毒接种49
• 1.2.2 SA处理49
• 1.2.3 基因表达的测定49-53
• 1.2.4 花叶病毒DAS-ELISA检测53
• 2 结果与分析53-61
• 2.1 SMV接种前后转基因大豆KR3基因、Hs1基因相对表达量分析53-54
• 2.2 转KR3、Hs1、KR3-Hs1基因植株大豆花叶病毒抗性测定54-55
• 2.3 SMV接种前后防御基因相对表达量分析55-58
• 2.4 SA处理SMV接种转基因大豆KR3基因、Hs1基因相对表达量分析58
• 2.5 SA处理转KR3、Hs1、KR3-Hs1基因植株大豆花叶病毒抗性测定58
• 2.6 SA处理SMV接种转基因大豆防御基因相对表达量分析58-61
• 3 讨论61-64
• 3.1 转基因植株基因表达与SMV抗性分析61-62
• 3.2 SA处理转基因植株基因表达与SMV抗性分析62-63
• 3.3 转基因植株的抗病毒效果63-64
• 第四章 结论与展望64-65
• 参考文献65-74

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