大肠杆菌血红素合成途径关键酶基因的表达与调控

发布时间：2021-04-29 01:23

　　血红素（heme）是一种重要的铁卟啉化合物,参与生物体内包括铁运输、抗氧化、信号调控以及多数血红素蛋白形成等生物功能。本论文以大肠杆菌（Escherichia coli）作为研究对象,以探究血红素合成途径中关键酶基因表达对终产物合成的调控为目标,通过转录组学对重组菌血红素合成的机理进行分析,并通过促进血红素合成的基因与芥蓝抗坏血酸过氧化物酶基因（apx）的共表达,增加内源血红素含量提高了过氧化物酶的活力。主要研究结果如下:（1）关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控。通过构建含有gltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD基因的同源重组大肠杆菌Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED、Eco/pEH和Eco/pEAD,发现hemA基因对血红素卟啉的合成有明显的促进作用,Eco/pEA血红素产量可达26.53μmmol·^-1,比对照组提升了8.08倍。而其他基因的过表达及hemA和hemD的共表达无明显效果。通过温度、溶氧及外源添加物对卟啉合成前体5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,5-... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：47 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 血红素简介
        1.1.1 血红素的结构特征
        1.1.2 血红素的生理功能与应用
        1.1.3 以血红素为辅基的过氧化物酶
    1.2 血红素的合成途径
    1.3 大肠杆菌血红素合成途径的研究进展
    1.4 立题意义与主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 质粒与菌株
        2.1.4 培养基及常用溶液配制
    2.2 血红素合成途径关键酶基因过表达方法
        2.2.1 重组单质粒的构建
        2.2.2 重组质粒的转化
        2.2.3 双基因共表达质粒的构建
        2.2.4 重组质粒的鉴定
    2.3 关键酶基因重组菌的表达与检测
        2.3.1 重组蛋白表达及SDS-PAGE检测
        2.3.2 卟啉血红素浓度检测
        2.3.3 环境因素的设置
        2.3.4 5-ALA检测
    2.4 RNA-seq与qRT-PCR分析方法
        2.4.1 RNA-seq分析方法
        2.4.3 qRT-PCR分析方法
    2.5 过氧化物酶的制备与检测
        2.5.1 重组酶的制备
        2.5.2 APX酶活检测
第三章 结果与讨论
    3.1 关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控
        3.1.1 表达菌株的构建
        3.1.2 单基因的表达及其对卟啉合成的影响
        3.1.3 hemA与hemD共表达及其对卟啉合成的影响
        3.1.4 环境因素对Eco/pEA中5-ALA及血红素产量影响
        3.1.5 小结
    3.2 重组菌血红素合成机理分析
        3.2.1 诱导剂浓度对Eco/pEA的GluTR蛋白表达和5-ALA产量的影响
        3.2.2 不同诱导条件下血红素合成途经的基因差异表达
        3.2.3 不同诱导条件下血红素合成相关的基因差异表达
        3.2.4 不同诱导条件下对其他代谢途径的影响
        3.2.5 RNA-seq验证与其他关键酶的转录分析
        3.2.6 小结
    3.3 共表达hemA和APX酶基因提高过氧化物酶APX酶活
        3.3.1 共表达体系的构建
        3.3.2 共表达体系重组酶的诱导表达
        3.3.3 共表达体系重组酶APX的酶活分析
        3.3.4 小结
主要结论及展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3166560