利用CRISPR-Cas9技术构建GNT1基因敲除细胞株

发布时间：2021-05-05 22:49

　　罕见病一般是指发病率低,患病人群较少的疾病,其中一类罕见病统称为溶酶体贮积症,葡萄糖脑苷脂病是一种家族性糖脂代谢疾病,也属于该类罕见病。该疾病的发病机制尚未完全明确,其有效的治疗方法主要为酶替代疗法。为了提高β-葡萄糖脑苷脂酶在酶替代疗法中的作用效力,其终端甘露糖残基须暴露在糖链外端,以使其能够与溶酶体内的甘露糖受体结合,从而作用于葡萄糖脑苷脂酶底物进行消化,达到治疗此病的目的。而β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ（GNT1）是哺乳动物细胞糖蛋白N端糖链加工的关键酶之一,能催化糖链由甘露糖型向杂合型转变。敲除GNT1基因可以提高甘露糖糖型含量,使其暴露在糖链终端。本研究利用新型的基因编辑工具规律成簇短回文重复CRISPRCas9 RNA引导核酸内切酶,对表达葡萄糖脑苷脂酶的CHO细胞进行了基因改造。通过设计针对目的基因GNT1的单引导RNA,引导CRISPR-Cas9核酸内切酶对GNT1基因进行了敲除,成功构建了GNT1基因敲除的单克隆细胞株。最终检测得出该细胞株表达产物β-葡萄糖脑苷脂酶中甘露糖糖型含量从0.5%上升至94.1%,目的产物酶活提高约24%。高甘露糖糖型含量能显著提高... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 罕见病的定义及现状
    1.2 溶酶体贮积症简介
    1.3 CRISPR-Cas9基因编辑技术
        1.3.1 基因编辑简介
        1.3.2 新型基因编辑工具
        1.3.3 CRISPR基因编辑技术简介
        1.3.4 CRISPR/Cas基因编辑技术的应用
    1.4 研究目的与研究思路
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料与试剂
        2.1.1 实验细胞
        2.1.2 实验用质粒
        2.1.3 实验用试剂
        2.1.4 细胞培养所用试剂及材料
        2.1.5 实验设备及仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞复苏、传代培养及冻存方法
        2.2.2 细胞转染方法
        2.2.3 细胞有限稀释法
        2.2.4 细胞流加培养实验
        2.2.5 葡萄糖脑苷脂酶酶活检测实验
        2.2.6 sgRNA引物设计
        2.2.7 sgRNA表达质粒构建
        2.2.8 T7E1核酸酶检测实验方法
    2.3 实验流程
第三章 GNT1基因敲除单克隆细胞株的成功构建
    3.1 sgRNA评估结果
    3.2 筛选敲除GNT1基因单克隆
    3.3 敲除GNT1基因的单克隆流加实验结果
    3.4 敲除GNT1基因单克隆目的产物酶糖型分析结果
    3.5 实验结果讨论
第四章 结论与展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文



本文编号：3170732