烟草抗虫相关候选负调控因子（NtCYP450和NtJIH1）的基因编辑及素材制备

发布时间：2021-05-10 17:30

　　众多农作物都面临着虫害的威胁,我国每年因为虫害威胁而损失的植物总量较大。据报道,虫害每年我国的农作物造成的损失高达近500亿斤。烟草（Nicotiana tabacum）作为一种重要的模式植物而被广泛用来研究植物与昆虫互作关系,以烟草为模式植物来研究植物的抗虫机制,对于培育抗虫农作物品种具有重要的理论及实践意义。目前我国针对农作物虫害的防治仍然以化学防治为主,生物防治为辅的状况。但这些防虫措施,尤其是化学防治,不仅给我们环境带来了严重的污染,而且也使害虫产生强烈的耐药性。尽管生物防治不会造成环境污染,但是防治害虫所用的性信息素一方面合成较为困难,另一方面性信息素较为特异,往往一种害虫对应一种性信息素,这也极大的限制了它的应用。通过基因工程培育抗虫害植物品种是伴随着分子生物学手段的进步而出现的一种比较理想的防治害虫的措施。近年来,最先出现的是利用Bt毒蛋白制备的抗虫转基因植株,虽然防治害虫的效果较好。但是,随着Bt作物的种植,害虫对Bt耐受性逐年增强。挖掘植物抗虫相关负调控因子,通过基因工程手段失活或调低对应基因进而培育抗虫品种是被认为是未来作物抗虫分子育种有一定潜力的方向。本项研究以栽... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 文献综述
    1.1 植物害虫的研究
        1.1.1 危害植物的主要害虫种类及危害特性
        1.1.2 植物抗虫反应及主要的信号途径
    1.2 生产上防治害虫的措施
        1.2.1 物理防治
        1.2.2 化学防治
        1.2.3 生物防治
        1.2.4 基因工程防治
    1.3 植物抗虫相关负调控因子的研究
        1.3.1 Cytochrome P450 在植物中的抗虫研究及其他功能
        1.3.2 Jasmonoyl-L-isoleucine hydrolase1(JIH1)在植物中的抗虫研究
    1.4 评价植物抗虫生理生化指标的相关研究
        1.4.1 植物胼胝质(Plant callose)
        1.4.2 植物过氧化氢酶(Plant catalase)
        1.4.3 植物胰蛋白酶抑制剂(Plant trypsin inhibitor)
        1.4.4 植物激素(Plant hormone)
第2章 引言
    2.1 研究背景与目的意义
    2.2 研究内容
        2.2.1 NtJIH1及NtCYP450 的鉴定及表达模式分析
        2.2.2 NtJIH1及NtCYP450 的过表达及敲除
        2.2.3 NtJIH1及NtCYP450 突变体的抗虫检测及抗性指标检测
    2.3 研究路线
第3章 NtJIH1和NtCYP450 的鉴定及表达模式分析
    3.1 实验材料与试剂
        3.1.1 物种数据的获取
        3.1.2 供试植物与昆虫的选取
        3.1.3 分析软件及网站
        3.1.4 主要试剂及耗材
        3.1.5 主要仪器
        3.1.6 主要溶液配制
    3.2 实验方法与步骤
        3.2.1 植物处理
        3.2.2 提取植物组织总RNA
        3.2.3 将RNA反转录成c DNA
        3.2.4 荧光定量PCR(q RT-PCR)检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 NtJIH1的鉴定及表达模式分析
        3.3.2 NtCYP450的鉴定及表达模式分析
    3.4 小结与讨论
第4章 NtJIH1及NtCYP450 的过表达及敲除
    4.1 实验材料与试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要实验试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 主要溶液配制
    4.2 实验方法与步骤
        4.2.1 目的基因的获取
        4.2.2 目的基因NtCYP450-1、NtCYP450-2、NtCYP450-3、NtJIH1-1、NtJIH1-2PCR扩增
        4.2.3 目的基因的回收
        4.2.4 目的基因的连接转化
        4.2.5 阳性克隆检测
        4.2.6 基因敲除靶位点的设计
        4.2.7 敲除载体的构建
        4.2.8 植物过表达载体的构建
        4.2.9 表达载体转化农杆菌
        4.2.10 农杆菌介导的遗传转化烟草叶片
        4.2.11 阳性植株的筛选
        4.2.12 RNA的提取,反转录及q RT-PCR检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 NtJIH1与NtCYP450的CDS序列的扩增
        4.3.2 敲除载体及植物过表达载体的构建
        4.3.3 农杆菌阳性转化子的筛选
        4.3.4 再生植株的获取及阳性植株的筛选
        4.3.5 获得的突变株及过表达植株的数量统计
        4.3.6 获得的突变株脱靶位点的分析
        4.3.7 获得的突变株防御相关基因的检测
    4.4 小结与讨论
第5章 NtJIH1及NtCYP450 突变体的抗虫检测及抗性指标检测
    5.1 实验材料与试剂
        5.1.1 供试植物与昆虫的选取
        5.1.2 主要耗材及主要仪器
        5.1.3 实验试剂
    5.2 实验方法与步骤
        5.2.1 突变体及过表达植株对棉铃虫体重及对蚜虫后代繁殖量的影响
        5.2.2 植物胼胝质,胰蛋白抑制剂,激素茉莉酸、水杨酸和乙烯及脂肪酸含量的ELISA法测定
        5.2.3 植物过氧化氢酶(CAT)含量的测定
        5.2.4 植物组织样品的荧光定量PCR检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 NtJIH1突变体及转基因植株对棉铃虫的抗性检测及抗性指标的检测
        5.3.2 NtJIH1突变体及转基因植株对桃蚜的抗性检测及抗性指标的检测
        5.3.3 NtCYP450突变体对棉铃虫的抗性检测及抗性指标的检测
        5.3.4 NtCYP450突变体对桃蚜的抗性检测及抗性指标的检测
        5.3.5 NtJIH1-1纯合突变株的表型观察
    5.4 小结与讨论
第6章 综合与讨论
参考文献
在读期间发表论文及参与课题
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]云南烟草农药施用与残留现状调查研究[D]. 李剑馨.湖南农业大学 2013
[2]甜菜夜蛾对光和性信息素行为反应及其应用研究[D]. 程文杰.华中农业大学 2013
[3]新疆不同棉花品种（系）的抗蚜性评价及其抗性机理研究[D]. 芦屹.石河子大学 2008



本文编号：3179768