棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析

发布时间：2021-05-19 22:55

　　棉花黄萎病是影响我国棉花品质和产量提高的主要病害,因此挖掘棉花抗黄萎病的关键基因以及阐明其分子作用机理非常必要。半胱氨酸蛋白酶基因C1A家族木瓜类半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases,PLCPs）在植物的广谱抗病中发挥着重要作用。本研究利用陆地棉TM-1分析了PLCPs的全基因组进化信息,并对家族成员GhRD21-7在棉花抗生物胁迫中的功能进行了分析,取得的主要研究结果如下:1.在陆地棉TM-1基因组中共鉴定到78个PLCPs成员。利用陆地棉和拟南芥PLCPs构建进化树,根据聚类结果所有的成员被分成了9个亚家族,分别命名为亚家族RD21、CEP、XCP、XBCP3、THI、SAG12、RD19、ALP和CTB。基因结构分析显示不同亚家族成员分别具有特异的结构和保守的motif,说明同一家族成员在进化上的保守性和功能上可能的相似性。2.PLCPs的组织表达模式分析表明PLCPs基因在花瓣和花药中表达量最高,其次是10 d纤维、种子萌发24 h的子叶、茎和开花10 d的胚珠。这些基因在柱头、子房和根中的表达量相对较低。表达模式分析表明共有35个PLC... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 植物与病原菌的相互作用
        1.1.1 植物的先天免疫系统
        1.1.2 水杨酸和茉莉酸介导的植物抗病反应机制
    1.2 棉花与黄萎病菌的相互作用
        1.2.1 黄萎病及黄萎病菌的致病机理
        1.2.2 棉花抗黄萎病遗传机制
        1.2.3 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性和生理生化抗性
        1.2.4 Ve1在棉花抗黄萎病菌中的作用
        1.2.5 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用
        1.2.6 质外体免疫在棉花抗黄萎病菌中的作用
    1.3 植物与害虫的相互作用
    1.4 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的研究进展
        1.4.1 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的分类和结构
        1.4.2 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的功能
    1.5 本研究的目的与意义
2 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 载体和菌株
    2.2 实验方法
        2.2.1 陆地棉PLCPs家族的全基因组鉴定
        2.2.2 系统进化树、基因结构及定位、保守序列及蛋白特征分析
        2.2.3 基因的表达模式分析
        2.2.4 GhRD21-7基因的克隆
        2.2.5 载体的构建
        2.2.6 DNA提取和Southern杂交检测
        2.2.7 RNA提取、反转录和实时定量PCR分析(qRT-PCR)
        2.2.8 黄萎病菌的接种检测
        2.2.9 病情指数统计
        2.2.10 病株剖杆和病原菌恢复培养
        2.2.11 灰霉接种检测
        2.2.12 斜纹夜蛾和棉铃虫的接虫实验
        2.2.13 酵母双杂实验
        2.2.14 转录组分析
3 结果与分析
    3.1 陆地棉PLCPs家族的鉴定
    3.2 陆地棉PLCPs家族的进化分析、保守基序和结构分析
    3.3 陆地棉PLCP基因家族的表达量分析
        3.3.1 陆地棉中PLCP基因家族的组织表达模式
        3.3.2 陆地棉中PLCP基因家族的逆境表达变化分析
        3.3.3 陆地棉中PLCP基因家族在接种黄萎病菌后的表达变化分析
        3.3.4 陆地棉中PLCP同源基因对的表达变化分析
    3.4 陆地棉GhRD21-7基因及其启动子的序列分析
    3.5 陆地棉GhRD21-7基因的组织表达模式和激素、黄萎病菌处理表达模式
    3.6 GhRD21-7稳定转基因株系的获得和检测
    3.7 超量表达GhRD21-7增强了棉花对黄萎病菌抗性
    3.8 GhRD21-7转基因材料对灰霉抗性不显著
    3.9 GhRD21-7转基因材料对鳞翅目害虫抗性不显著
    3.10 超量表达GhRD21-7的株系对黄萎病菌抗性增强不依赖于茉莉酸信号路径和水杨酸信号路径
    3.11 GhRD21-7有自激活效应
    3.12 超量表达GhRD21-7后的转录组分析
        3.12.1 测序质控总览
        3.12.2 样本的相关性分析
        3.12.3 差异表达基因筛选
        3.12.4 OE154_Mock vs WT_Mock中差异表达基因的分析
        3.12.5 OE154_V991 vs WT_V991中差异表达基因的分析
        3.12.6 OE154(V991 vs Mock)vs WT(V991 vs Mock)中差异表达基因的分析
4 讨论
    4.1 陆地棉PLCPs基因家族的鉴定和分析
    4.2 陆地棉PLCPs基因家族响应逆境和黄萎病菌的表达分析
    4.3 PLCPs在植物抗病中的作用
    4.4 超量表达GhRD21-7株系抗黄萎病菌的分子机理
    4.5 展望
参考文献
附录
    附录1:表达载体构建
    附录2:质粒的提取
    附录3:PCR产物纯化和酶切产物回收
    附录4:热激转化和电击转化
    附录5:植物基因组DNA提取
    附录6:Southern blotting
    附录7:RNA提取
    附录8:PDA、Czapek's配方
附表
博士期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国棉花产业发展现状及展望[J]. 卢秀茹,贾肖月,牛佳慧.  中国农业科学. 2018(01)
[2]中国棉花产业百年发展历程[J]. 喻树迅.  农学学报. 2018(01)
[3]我国棉花黄萎病研究十年回顾及展望[J]. 朱荷琴,李志芳,冯自力,冯鸿杰,魏锋,赵丽红,师勇强,刘世超,周京龙.  棉花学报. 2017(S1)
[4]近十年我国棉花虫害研究进展[J]. 雒珺瑜,张帅,任相亮,吕丽敏,张利娟,姬继超,马艳,崔金杰.  棉花学报. 2017(S1)
[5]棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Ve1[J]. 刘琳琳,张文文,周易,苗玉焕,许莲,刘敏,张坤,张献龙,朱龙付.  中国科学:生命科学. 2014(08)
[6]棉花抗黄萎病机制研究进展[J]. 徐理,朱龙付,张献龙.  作物学报. 2012(09)
[7]陆地棉抗黄萎病基因的分子标记定位[J]. 蒋锋,赵君,周雷,郭旺珍,张天真.  中国科学（C辑:生命科学）. 2009(09)
[8]国家棉花品种区域试验抗枯黄萎病鉴定方法[J]. 朱荷琴,吴征彬,邹奎,冯自力.  中国棉花. 2007(11)

博士论文
[1]半胱氨酸蛋白酶参与油菜绒毡层发育的分子调控机制[D]. 宋莉萍.华中农业大学 2016
[2]海岛棉乙烯响应因子GbERF1-like在抗黄萎病反应中的功能解析[D]. 郭伟锋.华中农业大学 2016
[3]棉花响应黄萎病菌分子机制的蛋白质组学研究及HDTF1基因的功能鉴定[D]. 高巍.华中农业大学 2014
[4]棉花与黄萎病菌的分子互作机制研究及GbWRKY1基因的功能鉴定[D]. 徐理.华中农业大学 2011
[5]棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制[D]. 金双侠.华中农业大学 2006

硕士论文
[1]棉花GbERF1基因的克隆与功能鉴定[D]. 金莉.华中农业大学 2012
[2]棉酚的提取纯化及其对棉铃虫、棉黄萎病的生物活性研究[D]. 刘泽辉.甘肃农业大学 2008



本文编号：3196585