异育银鲫Ⅰ型干扰素基因的克

发布时间：2021-05-21 06:58

　　异育银鲫（Carassius auratus gibelio）是我国主要的淡水养殖品种之一。由鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）感染引起的鲫造血器官坏死症是一种严重的病毒性传染病,给水产养殖业造成了巨大的经济损失,开展鲫鱼抗病毒防御机制研究对其病毒性疾病的防控具有重要的现实意义。干扰素（Interferon,IFN）是一类重要的分泌型细胞因子,能够抑制病毒增殖和调节机体免疫应答,在先天性和适应性免疫中发挥着重要作用。目前,I型干扰素（IFN-I）已在多种硬骨鱼类中得到研究,但有关异育银鲫IFN-I的研究还未深入开展。本研究克隆获得一种异育银鲫IFN-I基因（CagIFNa）,完成了对该基因的鉴定和序列结构分析,分析了CagIFNa在体内和体外的表达模式,并对CagIFNa在鲫鱼脑细胞系（Gibel carp brain cell line,GiCB）中抵抗CyHV-2感染的抗病毒活性进行了研究。旨在进一步揭示鱼类先天性抗病毒感染机制,为鲫鱼疱疹病毒造血器官坏死症的有效防控奠定理论基础。主要结果如下:1.CagIFNa的克隆和序列结构分析基于R... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略语表(按字母顺序排列)
第一章 文献综述
    1 硬骨鱼类Ⅰ型干扰素研究进展
        1.1 Ⅰ型干扰素的种类及表达特征
            1.1.1 Ⅰ型干扰素的种类
            1.1.2 Ⅰ型干扰素的表达特征
        1.2 硬骨鱼类Ⅰ型干扰素受体及信号转导通路
            1.2.1 Ⅰ型干扰素受体
            1.2.2 Ⅰ型干扰素信号转导通路
        1.3 硬骨鱼类Ⅰ型干扰素抗病毒功能及其应用
            1.3.1 Ⅰ型干扰素抗病毒功能
            1.3.2 Ⅰ型干扰素应用
    2 鲤疱疹病毒Ⅱ型研究进展
        2.1 流行病学
            2.1.1 流行区域
            2.1.2 传播特征
        2.2 临床症状及病理特征
        2.3 病原学
        2.4 检测技术
            2.4.1 电镜技术
            2.4.2 细胞培养技术
            2.4.3 分子生物学检测
                2.4.3.1 聚合酶链式反应(PCR)
                2.4.3.2 实时荧光定量PCR
                2.4.3.3 环介导等温扩增技术
    3 鱼类免疫系统的研究
第二章 异育银鲫Ⅰ型干扰素的克隆及生物信息学分析
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物、质粒和菌种
            1.1.2 主要试剂及耗材
            1.1.3 主要实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 异育银鲫组织样品RNA提取
            1.2.2 异育银鲫组织样品c DNA合成
            1.2.3 5'RACE-Ready c DNA和3'RACE-Ready c DNA合成
            1.2.4 RACE法扩增异育银鲫IFN-Ⅰ基因c DNA部分序列
            1.2.5 PCR产物胶回收
            1.2.6 PCR产物的连接与转化
            1.2.7 阳性克隆的筛选与测序鉴定
            1.2.8 普通PCR扩增确定Cag IFNa ORF序列全长
            1.2.9 生物信息学分析
    2 实验结果
        2.1 异育银鲫IFN-Ⅰ(Cag IFNa)核苷酸序列与氨基酸序列分析
        2.2 Cag IFNa氨基酸多序列比对分析
        2.3 Cag IFNa氨基酸系统进化树分析
    3 讨论
第三章 异育银鲫Ⅰ型干扰素组织表达分布与诱导表达
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 细胞及病毒
            1.1.3 实验试剂及耗材
            1.1.4 实验仪器及设备
        1.2 实验方法
            1.2.1 CyHV-2 的培养与病毒滴度测定
            1.2.2 健康异育银鲫各组织Cag IFNa的本底表达分析
            1.2.3 异育银鲫感染CyHV-2 后头肾和脾脏中Cag IFNa时序表达分析
            1.2.4 Poly I:C刺激和CyHV-2 感染后GiCB细胞中Cag IFNa时序表达分析
            1.2.5 荧光定量PCR引物设计及实验方法
            1.2.6 数据分析
    2 实验结果
        2.1 健康异育银鲫Cag IFNa的组织表达分布
        2.2 异育银鲫感染CyHV-2 后头肾和脾脏中Cag IFNa时序表达模式
        2.3 Poly Ⅰ:C刺激和CyHV-2 感染GiCB细胞后Cag IFNa时序表达模式
    3 讨论
第四章 异育银鲫Ⅰ型干扰素真核表达载体构建及抗病毒活性研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 细胞和病毒
            1.1.2 实验试剂及耗材
            1.1.3 实验仪器及耗材
        1.2 实验方法
            1.2.1 真核表达质粒pCMV-HA-Cag IFNa的构建
                1.2.1.1 Cag IFNa ORF片段的克隆
                1.2.1.2 Cag IFNa ORF与 pCMV-HA-N质粒的酶切与连接
                1.2.1.3 pCMV-HA-Cag IFNa超纯质粒的提取
            1.2.2 真核表达质粒pCMV-HA-Cag IFNa转染GiCB细胞
            1.2.3 Western-blot验证Cag IFNa基因的过表达
            1.2.4 GiCB细胞中过表达Cag IFNa后抗病毒活性研究
                1.2.4.1 细胞病变观察及病毒滴度测定
                1.2.4.2 荧光定量PCR检测病毒基因及Ⅰ型干扰素信号通路相关基因的表达
            1.2.5 数据分析
    2 实验结果
        2.1 pCMV-HA-Cag IFNa表达质粒的构建
            2.1.1 Cag IFNa基因ORF扩增
            2.1.2 阳性克隆筛选
        2.2 免疫印迹检测HA-Cag IFNa蛋白在GiCB细胞中的表达
        2.3 GiCB细胞感染CyHV-2 后的细胞形态学观察
        2.4 质粒转染后CyHV-2 病毒滴度及病毒相关基因检测
        2.5 质粒转染后IFN-Ⅰ系统相关基因的检测
    3 讨论
结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3199265