新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

发布时间：2017-04-21 12:15

  本文关键词：新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为纤维素复合酶系的重要组成部分,内切-β-葡聚糖酶在可再生纤维素资源的生物转化与利用、棉织物生物整理、制浆造纸以及轻工食品等领域中应用广泛。目前常用的纤维素酶生产菌种里氏木霉(Trichoderma reesei)所产的内切-p-葡聚糖酶仅适用于酸性反应体系,其应用范围受到了很大的限制。采用基因工程技术,构建新型内切-p-葡聚糖酶高产菌株,对于纤维素酶制剂的工业化应用具有重要的推动作用。刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可产生一种耐热、耐碱的内切-p-葡聚糖酶,具有重要的工业应用价值,但野生型刺糙青霉的产酶水平很低,难以实现规模化生产。本文以刺糙青霉的内切-p-葡聚糖酶基因(Egll)为研究对象,首先对其进行密码子优化,获得符合里氏木霉密码子偏好的新型内切-p-葡聚糖酶基因Eglln,该基因全长1175 bp,编码含387个氨基酸的成熟肽。之后将该基因置于里氏木霉强启动子Pcbhl(纤维二糖水解酶Ⅰ)及其信号肽和终止子Tcbhl(维二糖水解酶Ⅰ)之间,以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PET,该质粒同时含有目的基因Eglln和潮霉素筛选标记。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PET导入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上筛选获得226个阳性转化子,进一步通过复筛获得5个优良的重组转化子。将5个转化子重复传代培养10个批次后,分别提取染色体DNA进行PCR验证,均可检测到目的基因Eglln条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。采用SDS-PAGE蛋白电泳对转化子培养液进行检测,获得了与目的基因表达产物相符的蛋白条带(约41 kDa),表明Eglln已在重组里氏木霉中成功实现了胞外表达。重组转化子在30℃,摇瓶转速200 r/min条件下培养48 h,取发酵上清液在pH8.0,60℃条件下检测,内切-p-葡聚糖酶活力可高达382.6 U/ml,为宿主菌株的22.5倍。采用分批发酵工艺,在2 m3发酵罐中对重组转化子T1进行产酶试验,其碱性内切-p-葡聚糖酶活力在96 h可达到1070 U/ml,为摇瓶条件下的2.8倍。表明发酵罐条件下溶氧、搅拌的改善有利于目的基因在重组转化子中的高效表达。酶学性质研究结果表明：该酶耐热性能较好,在70℃以下性能稳定,其最适催化温度为60℃；该酶在pH 5.0-10.5范围内稳定性较好、具有明显的催化活性,其最适pH为8.0,属于碱性纤维素酶。Ca2+对重组内切-p-葡聚糖酶有明显的激活作用,而Hg2+、Mg2+、Al3+、zn3+、Cu2+.和Fe3+在一定程度减弱酶的催化作用,其中Hg2+可以完全抑制重组内切-p-葡聚糖酶活性。本文成功地实现了刺糙青霉内切-p-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果在里氏木霉纤维素酶的定向进化以及内切-p-葡聚糖酶的工业化应用方面具有重要的促进作用。
【关键词】：内切-β-葡聚糖酶 碱性纤维素酶 里氏木霉 基因克隆 基因重组 表达
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 绪论13-29
• 1.1 引言13
• 1.2 纤维素酶概述13-20
• 1.2.1 纤维素酶酶系组成13-14
• 1.2.2 纤维素酶的结构14-15
• 1.2.3 纤维素酶的作用机理15-17
• 1.2.4 纤维素酶的主要来源17
• 1.2.5 里氏木霉产纤维素酶概述17-20
• 1.2.6 青霉产纤维素酶概述20
• 1.3 纤维素酶活力测定20-21
• 1.4 纤维素酶的应用21-24
• 1.4.1 在废纸脱墨中的应用21-22
• 1.4.2 在纺织印染工业中的应用22-23
• 1.4.3 在生物质酒精工业中的应用23-24
• 1.5 丝状真菌表达体系24-27
• 1.5.1 转化方法24-25
• 1.5.2 丝状真菌遗传转化的选择标记25-26
• 1.5.3 丝状真菌表达体系研究现状26-27
• 1.6 本课题的研究思路和主要内容27-29
• 2 重组内切-β-葡聚糖酶基因Egl1n在里氏木霉中的表达29-50
• 2.1 引言29
• 2.2 材料与方法29-40
• 2.2.1 材料与试剂29-31
• 2.2.2 培养基31-32
• 2.2.3 实验仪器32
• 2.2.4 实验方法32-40
• 2.3 结果与讨论40-48
• 2.3.1 重组内切-β-葡聚糖酶基因Egl1n的获得40-41
• 2.3.2 重组载体的构建41-42
• 2.3.3 重组载体的验证分析42-44
• 2.3.4 Egl1n基因的序列分析44-45
• 2.3.5 根瘤农杆菌介导转化45
• 2.3.6 重组里氏木霉转化子的筛选45-46
• 2.3.7 重组里氏木霉PCR验证46-47
• 2.3.8 重组里氏木霉发酵液的蛋白质电泳检测47-48
• 2.4 小结48-50
• 3 重组里氏木霉产酶实验50-58
• 3.1 引言50
• 3.2 材料与方法50-53
• 3.2.1 材料与试剂50-51
• 3.2.2 培养基51-52
• 3.2.3 实验仪器52
• 3.2.4 实验方法52-53
• 3.3 结果与讨论53-56
• 3.3.1 重组里氏木霉摇瓶产酶结果53-54
• 3.3.2 重组里氏木霉摇瓶发酵的产酶进程54-55
• 3.3.3 发酵罐分批发酵试验55-56
• 3.4 小结56-58
• 4 重组内切-β-葡聚糖酶的酶学性质研究58-69
• 4.1 引言58
• 4.2 材料与方法58-63
• 4.2.1 材料和试剂58-60
• 4.2.2 培养基60-61
• 4.2.3 实验仪器61
• 4.2.4 实验方法61-63
• 4.3 结果与讨论63-67
• 4.3.1 温度对重组内切-β-葡聚糖酶活性的影响63
• 4.3.2 温度对重组内切-β-葡聚糖酶稳定性的影响63-64
• 4.3.3 pH对重组内切-β-葡聚糖酶活性的影响64-65
• 4.3.4 pH对重组内切-β-葡聚糖酶稳定性的影响65-66
• 4.3.5 金属离子对重组内切-β-葡聚糖酶的影响66-67
• 4.3.6 重组内切-β-葡聚糖酶稳定性试验性67
• 4.4 小结67-69
• 5 结论与展望69-72
• 5.1 结论69-70
• 5.1.1 目的基因Egl1n的获取与重组载体的构建69
• 5.1.2 根瘤农杆菌介导转化与重组转化子的筛选验证69-70
• 5.1.3 重组里氏木霉的发酵实验70
• 5.1.4 重组内切-β-葡聚糖的酶学性质研究70
• 5.2 展望70-72
• 参考文献72-81
• 附录：论文发表情况81

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本文编号：320334