纺锤链霉菌SD-07中多烯抗真菌抗生素济南霉素的生物合成及基因敲除初探

发布时间：2021-06-05 09:06

　　纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis）eriSD-07是本实验室2007年发现的一株放线菌,它所产的多烯大环内酯类抗生素是以五烯和七烯为主的混合物,五烯含量最高,并且五烯类的抗生素已经解析出化学结构,命名为济南霉素（Jinanmycin）,相比两性霉素B及制霉菌素,SD-07所产抗生素有更强的抗真菌活性,具有开发为新型抗真菌抗生素的潜力,因此有必要对济南霉素在SD-07中的生物合成路径以及其合成相关PKS基因簇的基因敲除工作进行一系列研究与探索。本文工作如下:1.纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序完成,并对济南霉素在SD-07中的生物合成进行了详细生物信息学分析SD-07基因组碱基总数为7593656bp,经antismash预测分析,共得到46个基因簇,其中cluster32最有可能为纺锤链霉菌SD-07多烯大环内酯类抗生素的编码基因簇,定位于4266507-4419580 bp,总大小153074bp,其中PKS相关基因定位于4286507-4388174bp,总大小101667bp,推测为合成济南霉素的基因簇。接下来对济南霉素在SD-07中的生物合成路径进行... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 链霉菌及多烯大环内酯类抗生素简介
    1.2 济南霉素简介
    1.3 链霉菌基因敲除方法简介
    1.4 Red/ET重组工程简介
        1.4.1 Red/ET重组的原理
        1.4.2 Red/ET重组工程的操作步骤
        1.4.3 Red/ET重组工程的应用
第二章 多烯大环内酯类抗生素济南霉素在纺锤链霉菌SD-07中的生物合成
    2.1 济南霉素简介
    2.2 济南霉素生物合成
        2.2.1 纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序
        2.2.2 PKS基因
        2.2.3 PKS后修饰和运输
        2.2.4 细胞色素P450酶
        2.2.5 糖基化
        2.2.6 输出
        2.2.7 其他基因
    2.3 本章总结
第三章 纺锤链霉菌SD-07敲除载体的构建及基因敲除初探
    3.1 研究背景
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株及质粒
        3.2.2 PCR引物
        3.2.3 培养基及化学试剂
        3.2.4 抗生素及使用浓度
    3.3 实验方法
        3.3.1 大肠杆菌和链霉菌属间接合转移
        3.3.2 PEG介导的原生质体转化
        3.3.3 电转化实验步骤
        3.3.4 敲除载体的构建
            3.3.4.1 PCR扩增
            3.3.4.2 PCR片段与载体的酶切连接
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 敲除载体pJTU1278-△2166以及pJTU12 78-△5883的构建
        3.4.2 确定抗生素工作浓度
        3.4.3 接合转移条件摸索
        3.4.4 电转化条件摸索
        3.4.5 PEG介导的原生质体转化法条件摸索
    3.5 本章总结
第四章 纺锤链霉菌SD-07中PKS基因簇克隆的探索
    4.1 研究背景
    4.2 实验设计
    4.3 实验材料
        4.3.1 菌株及质粒
        4.3.2 PCR引物
        4.3.3 培养基及化学试剂
        4.3.4 抗生素及使用浓度
        4.3.5 实验仪器
        4.3.6 DNA序列分析软件
    4.4 实验方法
        4.4.1 质粒DNA提取:BACs和质粒
        4.4.2 链霉菌基因组DNA提取
        4.4.3 纺锤链霉菌SD-07 Large part克隆
            4.4.3.1 BAC线性载体的制备
                4.4.3.1.1 11BACPCR扩增
                4.4.3.1.2 12 pBeloBAC11载体酶切处理
                4.4.3.1.3 过夜培养的大肠杆菌GBdir-gyrA462
                4.4.3.1.4 制备大肠杆菌GBdir-gyrA462感受态细胞
                4.4.3.1.5 构建载体13 pBeloBAC11
                4.4.3.1.6 13 pBeloBAC11酶切处理
            4.4.3.2 基因组DNA的限制性酶切以释放目标基因簇
            4.4.3.3 过夜培养大肠杆菌GBdir+pSC101
            4.4.3.4 制备大肠杆菌GBdir+pSC101感受态
            4.4.3.5 T4 DNA聚合酶使基因组DNA的和线性载体初步重组
            4.4.3.6 电穿孔法使基因组DNA的和线性载体导入大肠杆菌
            4.4.3.7 限制酶切分析筛选出正确的重组子
        4.4.4 纺锤链霉菌SD-07 Small part克隆
            4.4.4.1 线性载体25 pBR322构建
                4.4.4.1.1 载体25 pBR322组成片段PCR扩增
                4.4.4.1.2 载体25 pBR322初步重组
                4.4.4.1.3 构建载体25 pBR322
                4.4.4.1.4 载体25 pBR322的酶切
            4.4.4.2 基因组DNA的和线性载体初步重组
            4.4.4.3 Small part克隆至载体25 pBR322
    4.5 实验结果与分析讨论
        4.5.1 Large part克隆及限制酶切筛选分析
            4.5.1.1 SD-07基因组及Large part载体构建
            4.5.1.2 Large part克隆酶切筛选
        4.5.2 Small part克隆及限制酶切筛选分析
            4.5.2.1 Small part载体构建
            4.5.2.2 Small part克隆酶切筛选
    4.6 本章总结
全文总结与展望
参考文献
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]产广谱高效多烯类抗真菌抗生素的纺锤链霉菌SD-07（Streptomyces netropsis）的分离及鉴定[J]. 金建玲,王宠,雷涛,高培基.  山东大学学报(理学版). 2009(05)
[2]雷帕霉素产生菌吸水链霉菌NRRL5491接合转移系统的建立[J]. 杨旻,陶美凤.  华中农业大学学报. 2007(05)

硕士论文
[1]红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中多烯大环内酯类抗生素的生物合成研究[D]. 张慧.中国海洋大学 2013
[2]红色糖多孢菌基因敲除和SACE0069基因功能研究[D]. 古明珠.华东理工大学 2013



本文编号：3211869