多年生黑麦草LpCKX1基因CRISPR/Cas9靶向编辑载体的构建及遗传转化体系的建立
发布时间：2021-06-05 16:48
多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是具有生长快、分蘖多、耐牧、成坪速度快等优点的高价值饲用牧草。但因其籽粒小、饱满度差,严重降低了种子收获指数和种子质量,是全球范围内长期制约规模化种子生产效率的重要因素。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现对基因的定点编辑,可作为黑麦草通过基因工程手段进行种质创新的有力工具。然而,由于多年生黑麦草遗传转化体系尚不成熟且远远滞后于其他作物,为通过基因编辑对其进行定向改良带来困难。因此,建立高效遗传转化体系并通过CRISPR/Cas9技术对黑麦草种子产量潜力进行遗传改良,对于保证黑麦草种子生产和机械化收获均具有重要意义。本研究建立了新西兰多年生黑麦草品种NUI的愈伤组织诱导及再生体系,克隆了LpCKX1全长基因序列并构建了靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9基因编辑载体。为验证编辑载体的效率,对黑麦草原生质体的制备及转化条件进行了优化。主要结果如下:1、多年生黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立采用多年生黑麦草NUI的成熟种子作外植体,建立了多年生黑麦草高效再生体系。其中横切种子处理在添加5 mg/L的2,4-D的诱导培养基上,愈...
【文章来源】：烟台大学山东省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同的愈伤组织类型注：A为Ⅰ类，B为Ⅱ类，C为Ⅲ类
第二章黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立18312表2.4愈伤组织诱导率情况Table2.4Callusinductionrate11111221121212112222122213113223123230.000.003.330.000.000.002.501.6710.001.255.832.5054.761.3311.670.835.173.6016.673.3320.003.7516.678.33711.113.6018.334.1715.5211.6728.3310.0031.6717.5028.8111.861420.638.6328.338.4022.4120.0050.0023.3351.6725.0043.4827.832126.9817.0031.6716.2527.5927.8354.1726.6759.1737.5044.3536.52注：1：接种天数（d）；2：诱导率（%）；3：接种方式Note:1:inoculationdays（d）;2:inductionrate（%）;3:inoculationmode图2.2外植体处理组合131诱导的愈伤组织注：A:3天后出愈情况;B:14天后出愈情况;C:继代两次之后的愈伤组织Figure2.2Callusinduedviaexplanttreatmentcombination131Note:A:Callus3daysafterinoculation;B:Callus14daysafterinoculation;C:Callusaftertwosubcultures2.3.3不同浓度的6-BA对愈伤组织分化的影响将继代2次以上的黑麦草胚性愈伤组织转移到分化培养基上，在25℃、16h/d
第二章黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立20图2.3黑麦草愈伤植株再生过程A,B愈伤组织分化出芽;C,D:生根的再生植株;E,F:移栽苗Figure2.3PlantregenerationinperennialryegrassA,B:Callusdifferentiatedshoots;C,D:Rootedplantlets;E,F:Transplantedplants2.4讨论愈伤组织的诱导和分化是建立再生体系的两个关键步骤，其过程主要依靠外源激素的添加来调节生长情况。通常在植物愈伤组织的诱导中添加生长素类似物2,4-D来进行调节，它是比较常见的植物生长激素，可以通过促进细胞分裂和细胞伸长来使植物愈创表面细胞产生增殖能力。在绝大多数草坪草愈伤组织的诱导中，2,4-D都是不可缺少的外源激素。在多年生黑麦草愈伤组织诱导中，通常添加一定量的2,4-D来对其生长情况进行调节。本研究结果表明，在诱导培养基中添加浓度为5mg/L的2,4-D能够获得状态良好的胚性愈伤组织，且数量较多质量较好，能够满足后续的实验要求。在不添加2,4-D的情况下，种子发芽较多且没有愈伤组织产生，而随着培养基中添加的2,4-D浓度逐渐升高，愈伤组织诱导率也逐渐升高且发芽较少，得到的胚性愈伤组织也越来越多，当达到5mg/L之后，愈伤组织诱导率也随之慢慢下降且胚性愈伤组织数量减少，愈伤组织多成水渍状极易褐化，表明过高的2,4-D浓度不利于
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦常规育种与分子育种的结合探讨[J]. 仲敏. 农业开发与装备. 2019(10)
[2]多年生黑麦草分子标记应用及基因组研究进展[J]. 刘晓强,赵海滨,李新玲,张延明. 分子植物育种. 2020(02)
[3]玉米叶片原生质体的制备及瞬时转化体系的建立[J]. 雷海英,白凤麟,冯宇,郭亚冲,乔楠茜. 长治学院学报. 2018(02)
[4]基因编辑技术[J]. 胡小丹,游敏,罗文新. 中国生物化学与分子生物学报. 2018(03)
[5]植物原生质体分离方法及其应用研究进展[J]. 常胜合,孙威,许桂莺,王展,银曼妮,韩谦,魏卿,李敬阳,舒海燕. 分子植物育种. 2018(04)
[6]CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用[J]. 赵波,张余,张雨良. 热带作物学报. 2018(01)
[7]油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立[J]. 谷战英,杨若楠,陈昊. 林业科学. 2018(01)
[8]PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立[J]. 祁泽文,孙鑫博,樊波,张雪,袁建波,韩烈保. 草业学报. 2017(09)
[9]多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立[J]. 曾庆飞,韦鑫,陈锡,陈光洁,马培杰,吴佳海,王小利. 草业科学. 2017(08)
[10]禾谷类作物原生质体培养研究进展[J]. 郝艳芳,王良群,刘勇,张微,杨伟,白鸿雁,武擘. 中国农学通报. 2016(35)
博士论文
[1]日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）悬浮再生体系的建立与超低温保存研究[D]. 方文娟.北京林业大学 2008
[2]几种牧草和草坪草植物遗传转化体系的建立及其转基因研究[D]. 张振霞.甘肃农业大学 2002
硕士论文
[1]马铃薯原生质体培养再生及利用CRISPR/Cas9瞬时转化的研究[D]. 李晓.内蒙古大学 2019
[2]多年生黑麦草的抗旱性与基因多样性及干旱基因表达的关系[D]. 崔瑜.山西农业大学 2015
[3]大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用[D]. 徐坤.中国农业科学院 2014
[4]多年生黑麦草离体再生体系及农杆菌介导的高效遗传转化体系的建立[D]. 余斌.甘肃农业大学 2009
[5]多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导遗传转化因素的初步研究[D]. 梁华.西南大学 2009
[6]黑麦草离体再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究[D]. 何近刚.西北大学 2007
[7]几种草坪草的组织培养及遗传转化体系的建立[D]. 许瑾.山西大学 2006
[8]农杆菌介导的黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化及转基因植株再生[D]. 姜素云.山东大学 2005
本文编号：3212540
【文章来源】：烟台大学山东省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同的愈伤组织类型注：A为Ⅰ类，B为Ⅱ类，C为Ⅲ类
第二章黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立18312表2.4愈伤组织诱导率情况Table2.4Callusinductionrate11111221121212112222122213113223123230.000.003.330.000.000.002.501.6710.001.255.832.5054.761.3311.670.835.173.6016.673.3320.003.7516.678.33711.113.6018.334.1715.5211.6728.3310.0031.6717.5028.8111.861420.638.6328.338.4022.4120.0050.0023.3351.6725.0043.4827.832126.9817.0031.6716.2527.5927.8354.1726.6759.1737.5044.3536.52注：1：接种天数（d）；2：诱导率（%）；3：接种方式Note:1:inoculationdays（d）;2:inductionrate（%）;3:inoculationmode图2.2外植体处理组合131诱导的愈伤组织注：A:3天后出愈情况;B:14天后出愈情况;C:继代两次之后的愈伤组织Figure2.2Callusinduedviaexplanttreatmentcombination131Note:A:Callus3daysafterinoculation;B:Callus14daysafterinoculation;C:Callusaftertwosubcultures2.3.3不同浓度的6-BA对愈伤组织分化的影响将继代2次以上的黑麦草胚性愈伤组织转移到分化培养基上，在25℃、16h/d
第二章黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立20图2.3黑麦草愈伤植株再生过程A,B愈伤组织分化出芽;C,D:生根的再生植株;E,F:移栽苗Figure2.3PlantregenerationinperennialryegrassA,B:Callusdifferentiatedshoots;C,D:Rootedplantlets;E,F:Transplantedplants2.4讨论愈伤组织的诱导和分化是建立再生体系的两个关键步骤，其过程主要依靠外源激素的添加来调节生长情况。通常在植物愈伤组织的诱导中添加生长素类似物2,4-D来进行调节，它是比较常见的植物生长激素，可以通过促进细胞分裂和细胞伸长来使植物愈创表面细胞产生增殖能力。在绝大多数草坪草愈伤组织的诱导中，2,4-D都是不可缺少的外源激素。在多年生黑麦草愈伤组织诱导中，通常添加一定量的2,4-D来对其生长情况进行调节。本研究结果表明，在诱导培养基中添加浓度为5mg/L的2,4-D能够获得状态良好的胚性愈伤组织，且数量较多质量较好，能够满足后续的实验要求。在不添加2,4-D的情况下，种子发芽较多且没有愈伤组织产生，而随着培养基中添加的2,4-D浓度逐渐升高，愈伤组织诱导率也逐渐升高且发芽较少，得到的胚性愈伤组织也越来越多，当达到5mg/L之后，愈伤组织诱导率也随之慢慢下降且胚性愈伤组织数量减少，愈伤组织多成水渍状极易褐化，表明过高的2,4-D浓度不利于
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦常规育种与分子育种的结合探讨[J]. 仲敏. 农业开发与装备. 2019(10)
[2]多年生黑麦草分子标记应用及基因组研究进展[J]. 刘晓强,赵海滨,李新玲,张延明. 分子植物育种. 2020(02)
[3]玉米叶片原生质体的制备及瞬时转化体系的建立[J]. 雷海英,白凤麟,冯宇,郭亚冲,乔楠茜. 长治学院学报. 2018(02)
[4]基因编辑技术[J]. 胡小丹,游敏,罗文新. 中国生物化学与分子生物学报. 2018(03)
[5]植物原生质体分离方法及其应用研究进展[J]. 常胜合,孙威,许桂莺,王展,银曼妮,韩谦,魏卿,李敬阳,舒海燕. 分子植物育种. 2018(04)
[6]CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用[J]. 赵波,张余,张雨良. 热带作物学报. 2018(01)
[7]油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立[J]. 谷战英,杨若楠,陈昊. 林业科学. 2018(01)
[8]PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立[J]. 祁泽文,孙鑫博,樊波,张雪,袁建波,韩烈保. 草业学报. 2017(09)
[9]多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立[J]. 曾庆飞,韦鑫,陈锡,陈光洁,马培杰,吴佳海,王小利. 草业科学. 2017(08)
[10]禾谷类作物原生质体培养研究进展[J]. 郝艳芳,王良群,刘勇,张微,杨伟,白鸿雁,武擘. 中国农学通报. 2016(35)
博士论文
[1]日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）悬浮再生体系的建立与超低温保存研究[D]. 方文娟.北京林业大学 2008
[2]几种牧草和草坪草植物遗传转化体系的建立及其转基因研究[D]. 张振霞.甘肃农业大学 2002
硕士论文
[1]马铃薯原生质体培养再生及利用CRISPR/Cas9瞬时转化的研究[D]. 李晓.内蒙古大学 2019
[2]多年生黑麦草的抗旱性与基因多样性及干旱基因表达的关系[D]. 崔瑜.山西农业大学 2015
[3]大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用[D]. 徐坤.中国农业科学院 2014
[4]多年生黑麦草离体再生体系及农杆菌介导的高效遗传转化体系的建立[D]. 余斌.甘肃农业大学 2009
[5]多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导遗传转化因素的初步研究[D]. 梁华.西南大学 2009
[6]黑麦草离体再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究[D]. 何近刚.西北大学 2007
[7]几种草坪草的组织培养及遗传转化体系的建立[D]. 许瑾.山西大学 2006
[8]农杆菌介导的黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化及转基因植株再生[D]. 姜素云.山东大学 2005
本文编号：3212540
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