基于CRISPR/Cas9技术的HeLa细胞全基因组敲除文库的建立及初步应用
发布时间：2021-06-14 14:01
正向遗传学筛选可以揭示特定表型相对应的遗传基因,将生物现象与其相应的遗传因素直接联系起来。在哺乳动物的全基因组筛查中,CRISPR/Cas9基因编辑技术是开展正向遗传学筛选的一种强大而精准的方法。靶向人全基因组的sgRNA文库在Cas9内切酶作用下生成的突变细胞文库是进行表型高通量筛选的完美平台。基于该技术构建的不同细胞文库已广泛应用于多种功能型基因的筛选,包括药物作用基因筛选、肿瘤功能基因筛选及病毒感染基因筛选等。本文已利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了人全基因组敲除的HeLa细胞文库,并初步应用于HIV-1感染早期宿主依赖蛋白的筛选,亦为实验室后续研究提供有效的高通量筛选平台。本研究利用双质粒系统构建敲除细胞文库,即先将Cas9基因稳定表达于HeLa细胞中,在确定Cas9的高效蛋白切割活性前提下再导入人全基因组sgRNA文库构建敲除细胞库,以确保更低的脱靶效率。本研究分为4个实验部分:1.构建HeLa-Cas9细胞系。通过慢病毒载体系统,建立了稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系,利用流式分选细胞术获得9株表达Cas9的单克隆细胞系。之后利用pXPR-011质粒（该质...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统分类示意图(Khanetal.,2018)
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论3Pougachetal.,2010)。（3）干扰（Interference）阶段：成熟的crRNA招募Cas9蛋白特异性切割外源DNA，从而触发入侵噬菌体的DNA序列降解(Garneauetal.,2010,Hilleetal.,2018)。Cas9核酸酶包含HNH和RuvC两个结构域。当两个结构域激活时，HNH核酸酶结构域负责切割互补链，而RuvC结构域剪切非互补链(Jiangetal.,2017)。原间隔邻近基序（Protospaceradjacentmotif,PAM）在干扰阶段是至关重要的，因为Cas9蛋白在识别和切割外源核酸的过程中，需要先识别PAM，并在PAM上游3bp处形成双链断裂（DSB），造成外源基因的沉默(Mojicaetal.,2009)。图1-2CRISPR/Cas细菌适应性免疫系统的三个阶段：获取，crRNA合成和干扰(Carteretal.,2015)Fig.1-2ThethreestagesoftheCRISPR/Casbacterialadaptiveimmunesystem:acquisition,crRNAbiogenesisandinterference1.2CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9系统的主要作用机制是由Cas9核酸酶介导的DNA双链断裂，Martin等证实crRNA-tracrRNA复合物在Cas9发挥功能时是不可或缺的，因此运用化学合成的方法构建单个导向RNA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA包含crRNA-tracrRNA复合物配对序列及与靶基因互补的20nt序列，研究证实sgRNA同样可以结合Cas9蛋白发挥作用(Jineketal.,2012)。1.2.1CRISPR/Cas9基因编辑技术工作原理CRISPR/Cas9基因编辑技术是在CRISPR/Cas9系统的基础上进行一系列的优化改造形成的基因编辑技术，主要由Cas9蛋白和sgRNA两部分构成。
下，Cas9蛋白识别PAM序列，然后在PAM上游3bp形成双链断裂（DSB）。机体启动DSB修复机制，通常通过非同源末端连接（Non-homologousendjoining,NHEJ）或同源重组修复（Homologydirectedrepair,HDR）两种方式进行修复。在未有外源模板（Donor）时，NHEJ途径是哺乳动物DNA修复机制的主要形式(Devkota,2018)。但是NHEJ容易出错，在大多数情况下会缺失或者增加DNA序列造成移码突变，导致编码序列无法表达正常蛋白(Hugetal.,2016)。少数情况下，在有外源模板存在时，机体通过HDR修复实现精确的突变修复(Kakarougkasetal.,2014)。图1-3CRISPR/Cas9通过非同源末端连接或同源重组修复介导基因组编辑(Cruzetal.,2018)Fig.1-3CRISPR/Cas9-mediatedgenomeeditingvianon-homologousend-joiningorhomologydirectedrepair1.2.2CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用2013年，两个研究小组首次成功改造CRISPR/Cas9系统以完成在哺乳动物细胞中基因组的编辑(Congetal.,2013,Malietal.,2013)。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的逐渐完善和成熟，其在干细胞工程、癌症治疗和疾病动物建模等诸多领域都有应用。干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，通过体外诱导可分化为任何类型的组织器官，在疾病治疗和研究胚胎发育机制方面有巨大的潜在应用价值。Duchenne型肌营养不良（DMD）是由DMD基因突变而造成的基因功能丧失的疾玻研究人员利用CRISPR/Cas9技术提供正确的Donor模板，在DSB修复时以纠正DMD患者来源的诱导性多能干细胞（Inducedpluripotentstemcells,iPSCs）中的等位基因。iPSCs分化为骨骼肌细胞，表达正常功能的肌萎缩蛋白(Kyrychenkoetal.,2017,Lietal.,2015,Longetal.,2018,Youngetal.,2016)。
本文编号：3229979
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统分类示意图(Khanetal.,2018)
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论3Pougachetal.,2010)。（3）干扰（Interference）阶段：成熟的crRNA招募Cas9蛋白特异性切割外源DNA，从而触发入侵噬菌体的DNA序列降解(Garneauetal.,2010,Hilleetal.,2018)。Cas9核酸酶包含HNH和RuvC两个结构域。当两个结构域激活时，HNH核酸酶结构域负责切割互补链，而RuvC结构域剪切非互补链(Jiangetal.,2017)。原间隔邻近基序（Protospaceradjacentmotif,PAM）在干扰阶段是至关重要的，因为Cas9蛋白在识别和切割外源核酸的过程中，需要先识别PAM，并在PAM上游3bp处形成双链断裂（DSB），造成外源基因的沉默(Mojicaetal.,2009)。图1-2CRISPR/Cas细菌适应性免疫系统的三个阶段：获取，crRNA合成和干扰(Carteretal.,2015)Fig.1-2ThethreestagesoftheCRISPR/Casbacterialadaptiveimmunesystem:acquisition,crRNAbiogenesisandinterference1.2CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9系统的主要作用机制是由Cas9核酸酶介导的DNA双链断裂，Martin等证实crRNA-tracrRNA复合物在Cas9发挥功能时是不可或缺的，因此运用化学合成的方法构建单个导向RNA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA包含crRNA-tracrRNA复合物配对序列及与靶基因互补的20nt序列，研究证实sgRNA同样可以结合Cas9蛋白发挥作用(Jineketal.,2012)。1.2.1CRISPR/Cas9基因编辑技术工作原理CRISPR/Cas9基因编辑技术是在CRISPR/Cas9系统的基础上进行一系列的优化改造形成的基因编辑技术，主要由Cas9蛋白和sgRNA两部分构成。
下，Cas9蛋白识别PAM序列，然后在PAM上游3bp形成双链断裂（DSB）。机体启动DSB修复机制，通常通过非同源末端连接（Non-homologousendjoining,NHEJ）或同源重组修复（Homologydirectedrepair,HDR）两种方式进行修复。在未有外源模板（Donor）时，NHEJ途径是哺乳动物DNA修复机制的主要形式(Devkota,2018)。但是NHEJ容易出错，在大多数情况下会缺失或者增加DNA序列造成移码突变，导致编码序列无法表达正常蛋白(Hugetal.,2016)。少数情况下，在有外源模板存在时，机体通过HDR修复实现精确的突变修复(Kakarougkasetal.,2014)。图1-3CRISPR/Cas9通过非同源末端连接或同源重组修复介导基因组编辑(Cruzetal.,2018)Fig.1-3CRISPR/Cas9-mediatedgenomeeditingvianon-homologousend-joiningorhomologydirectedrepair1.2.2CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用2013年，两个研究小组首次成功改造CRISPR/Cas9系统以完成在哺乳动物细胞中基因组的编辑(Congetal.,2013,Malietal.,2013)。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的逐渐完善和成熟，其在干细胞工程、癌症治疗和疾病动物建模等诸多领域都有应用。干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，通过体外诱导可分化为任何类型的组织器官，在疾病治疗和研究胚胎发育机制方面有巨大的潜在应用价值。Duchenne型肌营养不良（DMD）是由DMD基因突变而造成的基因功能丧失的疾玻研究人员利用CRISPR/Cas9技术提供正确的Donor模板，在DSB修复时以纠正DMD患者来源的诱导性多能干细胞（Inducedpluripotentstemcells,iPSCs）中的等位基因。iPSCs分化为骨骼肌细胞，表达正常功能的肌萎缩蛋白(Kyrychenkoetal.,2017,Lietal.,2015,Longetal.,2018,Youngetal.,2016)。
本文编号：3229979
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