人hBD-2-haFGF融合基因原核表达的响应面优化
发布时间：2021-06-15 10:14
HBD-2-haFGF是一种具有痤疮治疗作用的新型融合蛋白。为提高重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21 （DE3）/pET-21b-hBD-2-haFGF中hBD-2-haFGF基因的表达水平,本研究尝试优化其诱导表达条件。分别选取IPTG浓度、诱导温度、培养基pH和诱导时间进行单因素试验,在此基础上设计4因素3水平响应面实验,以蛋白表达量作为考察指标。经过响应面分析,响应面二次回归方程为y=55.33-1.59A+0.754B+0.26C+6.33D-0.56AB+5.42AC+9.66AD-2.12BC-0.93BD-2.84CD-4.73A2-8.11B2-1.74C2-4.33D2。BL21（DE3）/pET-21b-hBD-2-haFGF的最优表达条件为:诱导温度39.52℃,IPTG浓度0.60 mmol/L,pH值7.95,时间3 h,预期灰度值为62.893。通过本研究可为进一步大量诱导制备、纯化hBD-2-haFGF蛋白提供技术支持。
【文章来源】：基因组学与应用生物学. 2020,39(08)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
各因素对hBD-2-haFGF表达的影响
在目前的痤疮治疗中，抗菌治疗和抑制瘢痕生成是两个重要的治疗方向。为此，在前期构建和表达了具有抗菌和抑制瘢痕生成的双功能重组蛋白h BD-2-ha FGF。h BD-2是一种来源于皮肤、呼吸道等上皮组织的阳离子抗菌肽。带正电荷的h BD-2可与带负电荷的细菌细胞膜结合，使细菌细胞膜的完整性受到破坏，胞内容物外泄，导致菌体死亡。在痤疮病损部位，皮脂腺痤疮丙酸杆菌为h BD-2的主要诱导源，可刺激皮脂腺细胞产生抗菌肽和h BD-2。ha FGF是成纤维细胞生长因子家族成员之一()。ha FGF能主动与伤口附近细胞膜上的特异性受体相结合，诱导伤口附近细胞分裂、增殖，促进皮肤和粘膜创面愈合并减少疤痕收缩和皮肤的畸形增生，快速高效修复创伤。在针对痤疮的临床治疗中，hb FGF联合点阵铒激光、微晶磨面等，促进痤疮瘢痕创面的愈合()。相对于hb FGF,ha FGF结合能力更强，更适合创面酸性环境，更为温和持久的生物学活性，在痤疮中可取得更佳的治疗效果()。通过基因工程可在体外大量发酵制备活性蛋白，但是发酵过程中蛋白的表达受诸多因素的影响，如培养基p H值、温度、IPTG浓度、时间、摇瓶体积和发酵时机等，此外多种因素之间还存在交互影响，简单的单因素实验并不能达到预期的效果，正交试验注重于科学的安排试验，寻找最佳的因素水平组合，但考虑因素之间的交互作用时，试验次数将显著增加(王艳等,2008,分析试验室,27(z2):333-334)。
通过基因工程可在体外大量发酵制备活性蛋白，但是发酵过程中蛋白的表达受诸多因素的影响，如培养基p H值、温度、IPTG浓度、时间、摇瓶体积和发酵时机等，此外多种因素之间还存在交互影响，简单的单因素实验并不能达到预期的效果，正交试验注重于科学的安排试验，寻找最佳的因素水平组合，但考虑因素之间的交互作用时，试验次数将显著增加(王艳等,2008,分析试验室,27(z2):333-334)。响应面法最早由英国科学家Box和Wilson提出，随后迅速发展，广泛应用于生物学、食品学及医药学等领域(田泱源和李瑞芳,2010)。响应面法是利用统计学的综合试验技术解决复杂系统输入与输出之间关系的一种方法，通过有限的试验次数建立各显著因素的一次项、平方项和因素之间交互作用项的数学模型，通过对函数响应面和等高线的分析，确定多因素系统的最佳条件(李莉等,2015)。响应面法相对于单因素试验和正交试验，具有试验次数少、周期短和精度高的优点，不仅考虑各因素对响应值的影响，还考虑因素之间的相互作用对响应值的影响(何佳鲜等,2017)。前期研究发现IPTG浓度、诱导温度、培养基p H值和诱导时间均对h BD-2-ha FGF的表达产生影响较大，在进一步的研究中选择了这4个因素进行单因素实验确定了各因素的最优水平。在此基础上进行了4因素3水平的响应面优化。本研究中，p H值和温度两个单因素可以显著影响h BD-2-ha FGF的产量，温度对重组蛋白的产量影响显著，低温会增加可溶性蛋白的比例，但降低蛋白的产量，较高的温度可以提高蛋白的产量(吴桐等,2016)，但过高的温度会导致大肠埃希菌的生长不适从而导致产量下降(黄孔威,2018)。在不同的文献报道中p H对蛋白产量的影响并不统一，这可能与蛋白的本身性质有关(张盛等,2008)，在本研究中，h BD-2-ha FGF在偏碱性环境下产量更高。时间-p H、时间-IPTG、时间-温度、p H-p H、时间-时间、温度-温度等交互因素均能对蛋白的表达具有显著影响，响应面图显示等高线呈现椭圆形。通过对回归方程的求解得到最佳诱导表达条件为：诱导温度39.52℃，IPTG浓度0.60 mmol/L,p H值7.95，时间3 h。通过本研究，为能大规模发酵制备h BD-2-ha FGF提供了理论依据。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组水蛭素的原核表达及分离纯化[J]. 黄孔威,李志鹏,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2018(01)
[2]鸭梨POD基因的原核表达及成熟度和降温方法对其表达量的影响[J]. 韩艳文,廉双秋,韩云云,池明,闫师杰. 食品科学. 2017(09)
[3]草莓FaMYB5基因原核表达的响应面优化[J]. 何佳鲜,江雷雨,洪敏,冯琛,刘勋菊,陈清,张勇,罗娅,王小蓉,汤浩茹. 基因组学与应用生物学. 2017(01)
[4]金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表达[J]. 吴桐,徐文峰,年四季,叶迎春,袁青. 中国免疫学杂志. 2016(04)
[5]碱性成纤维细胞生长因子联合修护霜对激光治疗痤疮瘢痕术后创面愈合的影响[J]. 李敏,李雪莉,李旭阳,张守民,禹卉千,邓丽娜,李丽娜,郑颖娜,尹光文,李振鲁. 中国皮肤性病学杂志. 2015(10)
[6]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 李莉,张赛,何强,胡学斌. 实验室研究与探索. 2015(08)
[7]响应面法在生物过程优化中的应用[J]. 田泱源,李瑞芳. 食品工程. 2010(02)
[8]pH对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素的降解影响[J]. 张盛,郝玉有,储炬,王永红,郭美锦,张嗣良,庄英萍. 生物工程学报. 2008(01)
本文编号：3230868
【文章来源】：基因组学与应用生物学. 2020,39(08)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
各因素对hBD-2-haFGF表达的影响
在目前的痤疮治疗中，抗菌治疗和抑制瘢痕生成是两个重要的治疗方向。为此，在前期构建和表达了具有抗菌和抑制瘢痕生成的双功能重组蛋白h BD-2-ha FGF。h BD-2是一种来源于皮肤、呼吸道等上皮组织的阳离子抗菌肽。带正电荷的h BD-2可与带负电荷的细菌细胞膜结合，使细菌细胞膜的完整性受到破坏，胞内容物外泄，导致菌体死亡。在痤疮病损部位，皮脂腺痤疮丙酸杆菌为h BD-2的主要诱导源，可刺激皮脂腺细胞产生抗菌肽和h BD-2。ha FGF是成纤维细胞生长因子家族成员之一()。ha FGF能主动与伤口附近细胞膜上的特异性受体相结合，诱导伤口附近细胞分裂、增殖，促进皮肤和粘膜创面愈合并减少疤痕收缩和皮肤的畸形增生，快速高效修复创伤。在针对痤疮的临床治疗中，hb FGF联合点阵铒激光、微晶磨面等，促进痤疮瘢痕创面的愈合()。相对于hb FGF,ha FGF结合能力更强，更适合创面酸性环境，更为温和持久的生物学活性，在痤疮中可取得更佳的治疗效果()。通过基因工程可在体外大量发酵制备活性蛋白，但是发酵过程中蛋白的表达受诸多因素的影响，如培养基p H值、温度、IPTG浓度、时间、摇瓶体积和发酵时机等，此外多种因素之间还存在交互影响，简单的单因素实验并不能达到预期的效果，正交试验注重于科学的安排试验，寻找最佳的因素水平组合，但考虑因素之间的交互作用时，试验次数将显著增加(王艳等,2008,分析试验室,27(z2):333-334)。
通过基因工程可在体外大量发酵制备活性蛋白，但是发酵过程中蛋白的表达受诸多因素的影响，如培养基p H值、温度、IPTG浓度、时间、摇瓶体积和发酵时机等，此外多种因素之间还存在交互影响，简单的单因素实验并不能达到预期的效果，正交试验注重于科学的安排试验，寻找最佳的因素水平组合，但考虑因素之间的交互作用时，试验次数将显著增加(王艳等,2008,分析试验室,27(z2):333-334)。响应面法最早由英国科学家Box和Wilson提出，随后迅速发展，广泛应用于生物学、食品学及医药学等领域(田泱源和李瑞芳,2010)。响应面法是利用统计学的综合试验技术解决复杂系统输入与输出之间关系的一种方法，通过有限的试验次数建立各显著因素的一次项、平方项和因素之间交互作用项的数学模型，通过对函数响应面和等高线的分析，确定多因素系统的最佳条件(李莉等,2015)。响应面法相对于单因素试验和正交试验，具有试验次数少、周期短和精度高的优点，不仅考虑各因素对响应值的影响，还考虑因素之间的相互作用对响应值的影响(何佳鲜等,2017)。前期研究发现IPTG浓度、诱导温度、培养基p H值和诱导时间均对h BD-2-ha FGF的表达产生影响较大，在进一步的研究中选择了这4个因素进行单因素实验确定了各因素的最优水平。在此基础上进行了4因素3水平的响应面优化。本研究中，p H值和温度两个单因素可以显著影响h BD-2-ha FGF的产量，温度对重组蛋白的产量影响显著，低温会增加可溶性蛋白的比例，但降低蛋白的产量，较高的温度可以提高蛋白的产量(吴桐等,2016)，但过高的温度会导致大肠埃希菌的生长不适从而导致产量下降(黄孔威,2018)。在不同的文献报道中p H对蛋白产量的影响并不统一，这可能与蛋白的本身性质有关(张盛等,2008)，在本研究中，h BD-2-ha FGF在偏碱性环境下产量更高。时间-p H、时间-IPTG、时间-温度、p H-p H、时间-时间、温度-温度等交互因素均能对蛋白的表达具有显著影响，响应面图显示等高线呈现椭圆形。通过对回归方程的求解得到最佳诱导表达条件为：诱导温度39.52℃，IPTG浓度0.60 mmol/L,p H值7.95，时间3 h。通过本研究，为能大规模发酵制备h BD-2-ha FGF提供了理论依据。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组水蛭素的原核表达及分离纯化[J]. 黄孔威,李志鹏,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2018(01)
[2]鸭梨POD基因的原核表达及成熟度和降温方法对其表达量的影响[J]. 韩艳文,廉双秋,韩云云,池明,闫师杰. 食品科学. 2017(09)
[3]草莓FaMYB5基因原核表达的响应面优化[J]. 何佳鲜,江雷雨,洪敏,冯琛,刘勋菊,陈清,张勇,罗娅,王小蓉,汤浩茹. 基因组学与应用生物学. 2017(01)
[4]金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表达[J]. 吴桐,徐文峰,年四季,叶迎春,袁青. 中国免疫学杂志. 2016(04)
[5]碱性成纤维细胞生长因子联合修护霜对激光治疗痤疮瘢痕术后创面愈合的影响[J]. 李敏,李雪莉,李旭阳,张守民,禹卉千,邓丽娜,李丽娜,郑颖娜,尹光文,李振鲁. 中国皮肤性病学杂志. 2015(10)
[6]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 李莉,张赛,何强,胡学斌. 实验室研究与探索. 2015(08)
[7]响应面法在生物过程优化中的应用[J]. 田泱源,李瑞芳. 食品工程. 2010(02)
[8]pH对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素的降解影响[J]. 张盛,郝玉有,储炬,王永红,郭美锦,张嗣良,庄英萍. 生物工程学报. 2008(01)
本文编号：3230868
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