糙米中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其毒力基因与药敏性检测
发布时间：2021-06-19 13:29
本文从一份糙米样品中分离纯化出5株细菌,分别命名为BR1、BR2、BR3、BR4和BR5,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA及gyr B基因测序鉴定,并对其毒力基因及药物敏感性等生物学特征进行研究。结果表明,5株分离菌株生化特性符合蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的特性,结合16S rRNA及gyr B基因测序结果,菌株BR1和BR4鉴定为蜡样芽孢杆菌。毒力基因的PCR检测结果表明,菌株BR1和BR4携带肠毒素基因（hbl、nhe、ent FM和bce T）和细胞毒素K基因（cyt K）,未检测到呕吐型毒力基因（cer和ces）。菌株BR1和BR4对青霉素、氨苄西林和头孢噻肟等药物耐药,对阿莫西林中度敏感,对诺氟沙星、环丙沙星和庆大霉素等药物敏感。本研究通过分离鉴定糙米源蜡样芽孢杆菌,发现分离菌株携带多种毒力基因,并且对青霉素类、头孢菌素类及磺胺类等药物耐药,表明糙米中的蜡样芽孢杆菌有引起食源性疾病的风险。
【文章来源】：现代食品科技. 2020,36(10)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
图1 分离菌株形态学特征：（a）营养琼脂；（b）甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基；（c）胰酪胨大豆羊血琼脂；（d）蛋白质毒素结晶染色；（e）芽孢染色
经PCR检测，试验结果表明分离菌株BR1的DNA中除hbl B、ces和cer外，剩余9种毒力基因hbl A、hbl C、hbl D、nhe A、nhe B、nhe C、ent FM、cyt K和bce T均能检测到。并测得9种毒力基因片段大小分别为1154、740、829、500、770、582、1269、812和428 bp左右（图6）。分离菌株BR4的DNA中除ces和cer外，剩余10种毒力基因均存在（图7）。由此可知，菌株BR1携带溶血性肠毒素毒力基因hbl A、hbl C、hbl D，非溶血性肠毒素毒力基因nhe A、nhe B、nhe C及肠毒素毒力基因ent FM、bce T，细胞毒素毒力基因cyt K，不携带呕吐型毒素毒力基因ces、cer。菌株BR4还含有溶血性肠毒素毒力基因hbl B。蜡样芽孢杆菌的致病性与其携带的毒力基因直接相关，溶血性肠毒素BL(Hbl）和非溶血性肠毒素（Nhe）均为复合型毒素，全部组分的共同参与能使其毒力达到最大，有研究显示只有含有Hbl全部基因的菌株才会产生溶血效应[12]。毒力基因检测结果表明，菌株BR1和BR4含有Hbl三个全部基因，说明这两株分离菌株能够产生溶血毒素Hbl，对消费者会产生危害。此外，非溶血性肠毒素nhe基因（nhe A、nhe B、nhe C）、肠毒素毒力基因ent FM、bce T和细胞毒素毒力基因cyt K均在菌株BR1和BR4中被检出，这些毒素基因同样能引起消费者腹泻等不良反应。本研究毒力基因携带结果与崔一龙等[24]、宋丽丽等[25]结果基本一致，即hbl、nhe、cyt K、ent FM和bce T基因的检出率偏高，这些毒力基因编码的毒素也被认为是我国食源性蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子[12]。张明明等[15]针对餐饮服务场所即食米面制品中蜡样芽孢杆菌的污染状况进行研究，检出蜡样芽孢杆菌49株，结果发现所有分离菌株均检出两种或两种以上的毒力基因，其中非溶血性肠毒素基因nhe和ent FM检出率最高，同时携带nhe三个基因又携带hbl A、hbl C和hbl D基因的强毒株有7株，占4.29%。本研究中菌株BR1和BR4都同时携带3种及以上BL和Nhe毒力基因，表明其具有强致腹泻功能。综上所述，溶血性肠毒素BL基因、非溶血性肠毒素Nhe基因和细胞毒素基因是目前淀粉质食物糙米中蜡样芽孢杆菌菌株携带的主要毒素基因，以引起消费者腹泻等不良反应为主。2.5 药敏试验结果
2.3.1 菌株16S r RNA基因PCR扩增结果及进化树分析常用细菌的分类主要从菌落的形态特征及一系列生理生化试验来确定[16]。然而传统的分类鉴别方法步骤繁琐、鉴定周期较长，且大多性状由主观来判断，易给试验结果判定带来误差。由于16S r DNA的信息量足够大，序列大小适中（1.5 kb），在进化上速度慢，并且在本质上和功能上具有高度的保守性，因而被选作生物进化过程中的标尺，常用于生物的系统分类[17]。鉴定的5株分离菌BR1、BR2、BR3、BR4和BR516S r RNA基因PCR扩增产物凝胶电泳结果如图2所示。由图2可知，5株分离菌在1500 bp位置都出现宽亮条带，测序结果表明菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列长度均在1500 bp左右。将测得的16S r RNA基因序列提交到NCBI和Ez Bio Cloud核酸数据库中行BLAST在线分析。运用MEGA 7.0软件，将测出的序列与16S r RNA基因序列进行同源性对比。菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列系统发育树如图3所示。根据图3中16S r RNA基因序列分析结果，菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5 16S r RNA基因序列与多种芽孢杆菌如蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC 14579）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides DSM 2048）及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ATCC 10792）等同源性均很高，因此可初步将5株分离菌株归类为芽孢杆菌属，然而无法确定5株分离菌株具体为哪一种菌。
【参考文献】：
期刊论文
[1]1株牛源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测[J]. 宋丽丽,张玲艳,贾伟娟,白志恒,刘媛,陈云娇,王学理. 西北农业学报. 2019(11)
[2]猪源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定与部分生物学特性分析[J]. 江地科,项明源,王印,姚学萍,杨泽晓,张鹏飞,廖倡宇,朱光恒,姜睿娇. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[3]鲫鱼肠道蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特征[J]. 陈丰,黄亚冬,孙敬锋,吕爱军,胡秀彩,石洪玥,邢克智. 江苏农业科学. 2019(18)
[4]即食米面制品中蜡样芽胞杆菌分离鉴定及毒力基因研究[J]. 张明明,梁美丹,肖剑,张彬彬,蒋佳希,宋安华. 食品工业科技. 2019(22)
[5]马源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测[J]. 崔一龙,石芸,杨达汉,尹有勤,薛江东,霍晓伟,马德慧. 浙江农业学报. 2019(02)
[6]食品中蜡样芽孢杆菌的分离及携带毒力基因的检测[J]. 白凤岚,陈松,罗梦幽,曾宝锋,唐俊妮. 现代食品科技. 2018(10)
[7]蜡样芽孢杆菌检测方法研究进展[J]. 黄晶菁,罗静,何宏轩. 中国畜牧兽医. 2018(03)
[8]半滑舌鳎源蜡样芽孢杆菌毒性检测及药敏试验[J]. 王琰,高四合,单建杰,罗璋,刘金兰. 水产科学. 2018(01)
[9]棘胸蛙致病性蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及病理组织观察[J]. 吕耀平,金晶,施倩,陈洁,刘子明,陆君,黄富友,傅旭豪. 水生生物学报. 2018(01)
[10]生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究[J]. 田万帆,张荣,龙虎,柳琳,贺苏皖,杜玄,蒋敏,赵悦,唐俊妮. 食品工业科技. 2018(06)
硕士论文
[1]猪源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定[D]. 赵振宇.湖南农业大学 2014
本文编号：3237899
【文章来源】：现代食品科技. 2020,36(10)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
图1 分离菌株形态学特征：（a）营养琼脂；（b）甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基；（c）胰酪胨大豆羊血琼脂；（d）蛋白质毒素结晶染色；（e）芽孢染色
经PCR检测，试验结果表明分离菌株BR1的DNA中除hbl B、ces和cer外，剩余9种毒力基因hbl A、hbl C、hbl D、nhe A、nhe B、nhe C、ent FM、cyt K和bce T均能检测到。并测得9种毒力基因片段大小分别为1154、740、829、500、770、582、1269、812和428 bp左右（图6）。分离菌株BR4的DNA中除ces和cer外，剩余10种毒力基因均存在（图7）。由此可知，菌株BR1携带溶血性肠毒素毒力基因hbl A、hbl C、hbl D，非溶血性肠毒素毒力基因nhe A、nhe B、nhe C及肠毒素毒力基因ent FM、bce T，细胞毒素毒力基因cyt K，不携带呕吐型毒素毒力基因ces、cer。菌株BR4还含有溶血性肠毒素毒力基因hbl B。蜡样芽孢杆菌的致病性与其携带的毒力基因直接相关，溶血性肠毒素BL(Hbl）和非溶血性肠毒素（Nhe）均为复合型毒素，全部组分的共同参与能使其毒力达到最大，有研究显示只有含有Hbl全部基因的菌株才会产生溶血效应[12]。毒力基因检测结果表明，菌株BR1和BR4含有Hbl三个全部基因，说明这两株分离菌株能够产生溶血毒素Hbl，对消费者会产生危害。此外，非溶血性肠毒素nhe基因（nhe A、nhe B、nhe C）、肠毒素毒力基因ent FM、bce T和细胞毒素毒力基因cyt K均在菌株BR1和BR4中被检出，这些毒素基因同样能引起消费者腹泻等不良反应。本研究毒力基因携带结果与崔一龙等[24]、宋丽丽等[25]结果基本一致，即hbl、nhe、cyt K、ent FM和bce T基因的检出率偏高，这些毒力基因编码的毒素也被认为是我国食源性蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子[12]。张明明等[15]针对餐饮服务场所即食米面制品中蜡样芽孢杆菌的污染状况进行研究，检出蜡样芽孢杆菌49株，结果发现所有分离菌株均检出两种或两种以上的毒力基因，其中非溶血性肠毒素基因nhe和ent FM检出率最高，同时携带nhe三个基因又携带hbl A、hbl C和hbl D基因的强毒株有7株，占4.29%。本研究中菌株BR1和BR4都同时携带3种及以上BL和Nhe毒力基因，表明其具有强致腹泻功能。综上所述，溶血性肠毒素BL基因、非溶血性肠毒素Nhe基因和细胞毒素基因是目前淀粉质食物糙米中蜡样芽孢杆菌菌株携带的主要毒素基因，以引起消费者腹泻等不良反应为主。2.5 药敏试验结果
2.3.1 菌株16S r RNA基因PCR扩增结果及进化树分析常用细菌的分类主要从菌落的形态特征及一系列生理生化试验来确定[16]。然而传统的分类鉴别方法步骤繁琐、鉴定周期较长，且大多性状由主观来判断，易给试验结果判定带来误差。由于16S r DNA的信息量足够大，序列大小适中（1.5 kb），在进化上速度慢，并且在本质上和功能上具有高度的保守性，因而被选作生物进化过程中的标尺，常用于生物的系统分类[17]。鉴定的5株分离菌BR1、BR2、BR3、BR4和BR516S r RNA基因PCR扩增产物凝胶电泳结果如图2所示。由图2可知，5株分离菌在1500 bp位置都出现宽亮条带，测序结果表明菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列长度均在1500 bp左右。将测得的16S r RNA基因序列提交到NCBI和Ez Bio Cloud核酸数据库中行BLAST在线分析。运用MEGA 7.0软件，将测出的序列与16S r RNA基因序列进行同源性对比。菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列系统发育树如图3所示。根据图3中16S r RNA基因序列分析结果，菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5 16S r RNA基因序列与多种芽孢杆菌如蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC 14579）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides DSM 2048）及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ATCC 10792）等同源性均很高，因此可初步将5株分离菌株归类为芽孢杆菌属，然而无法确定5株分离菌株具体为哪一种菌。
【参考文献】：
期刊论文
[1]1株牛源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测[J]. 宋丽丽,张玲艳,贾伟娟,白志恒,刘媛,陈云娇,王学理. 西北农业学报. 2019(11)
[2]猪源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定与部分生物学特性分析[J]. 江地科,项明源,王印,姚学萍,杨泽晓,张鹏飞,廖倡宇,朱光恒,姜睿娇. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[3]鲫鱼肠道蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特征[J]. 陈丰,黄亚冬,孙敬锋,吕爱军,胡秀彩,石洪玥,邢克智. 江苏农业科学. 2019(18)
[4]即食米面制品中蜡样芽胞杆菌分离鉴定及毒力基因研究[J]. 张明明,梁美丹,肖剑,张彬彬,蒋佳希,宋安华. 食品工业科技. 2019(22)
[5]马源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测[J]. 崔一龙,石芸,杨达汉,尹有勤,薛江东,霍晓伟,马德慧. 浙江农业学报. 2019(02)
[6]食品中蜡样芽孢杆菌的分离及携带毒力基因的检测[J]. 白凤岚,陈松,罗梦幽,曾宝锋,唐俊妮. 现代食品科技. 2018(10)
[7]蜡样芽孢杆菌检测方法研究进展[J]. 黄晶菁,罗静,何宏轩. 中国畜牧兽医. 2018(03)
[8]半滑舌鳎源蜡样芽孢杆菌毒性检测及药敏试验[J]. 王琰,高四合,单建杰,罗璋,刘金兰. 水产科学. 2018(01)
[9]棘胸蛙致病性蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及病理组织观察[J]. 吕耀平,金晶,施倩,陈洁,刘子明,陆君,黄富友,傅旭豪. 水生生物学报. 2018(01)
[10]生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究[J]. 田万帆,张荣,龙虎,柳琳,贺苏皖,杜玄,蒋敏,赵悦,唐俊妮. 食品工业科技. 2018(06)
硕士论文
[1]猪源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定[D]. 赵振宇.湖南农业大学 2014
本文编号：3237899
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