耐草甘膦基因aroA A1501 的拆分及功能重建
发布时间：2021-07-01 08:21
自转基因作物商业化应用以来,耐除草剂一直是转基因作物的主要性状,2019年耐除草剂转基因作物的种植面积占全球转基因作物种植面积的46%。转基因耐除草剂作物的大面积种植带来了巨大的经济和社会效益,但草甘膦抗性杂草的出现也引起了人们对其产生的环境风险的广泛关注。基因拆分技术培育的转基因作物能够很好的避免目标性状逃逸到环境中所带来的影响,是防控基因飘流和防止耐草甘膦杂草产生的有效措施。为了利用基因拆分技术培育aroAA1501基因耐草甘膦水稻,本研究通过结构分析法筛选基因的可拆分位点,并通过功能互补试验获得基因的可拆分位点,通过原核系统分析比较不同位点拆分后,在intein介导下重新组装蛋白的草甘膦耐受性及酶动力参数,获得适宜的可拆分位点,研究结果为利用基因拆分技术培育耐草甘膦的转基因水稻提供技术支撑,同时为利用基因拆分技术防控基因飘流、预防耐草甘膦杂草产生提供技术储备。具体研究结果如下:1)生物信息学分析预测aroAA1501基因编码的EPSPS蛋白的一级结构、二级结构和三级结构,根据蛋白结构预测出了13个可能拆分的位点。利用PCR的方法将aro...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
莽草酸合成途径和草甘膦作用位点（GOMESetal.,2014）
016），目前转G10-aroA基因的玉米已于2020年1月获得安全证书，具有良好的应用前景。来源于荧光假单胞菌G2菌株的G2-aroA基因，能够赋予转基因水稻、玉米、大豆、棉花、烟草和油菜等耐受草甘膦的能力（ZHANGetal.,2015;DONGetal.,2017;GUOetal.,2015;DUNetal.,2007;WANGetal.,2014），利用G2-aroA基因培育的转基因玉米已进入安全证书申报阶段。1.1.2.2EPSPS基因突变EPSP合酶第90-120氨基酸区段为与草甘膦的结合区，其中第96位的甘氨酸是与草甘膦结合的活性位点，另外，第123-134、140-152和355-367肽段也与草甘膦的结合有关（图1-2）（PADGETTetal.,1991;KREKELetal.,1999）。因此，这些区段的单一或多个氨基酸发生突变，会使得EPSPS与草甘膦的结合活性降低，具有草甘膦抗性。靳传娣利用重叠延伸法对来源于可变盐单胞菌（Halomonasvarabilis）的EPSPS基因（H.Var-EPSPS）进行突变，获得了S99A和G100A双突变的H.Var-EPSPS基因，将突变基因导入玉米后培育出了耐受草甘膦的转基因玉米植株（靳传娣，2016）。Lebrun等利用定点突变技术对玉米的EPSPS基因进行突变，获得了102位（用异亮氨酸代替苏氨酸）和106位（用丝氨酸代替脯氨酸)突变的双突变基因2mepsps（LEBRUNetal.,1997），将基因导入棉花、大豆、玉米后，获得了耐受草甘膦的转基因植株，含有2mepsps的转基因大豆DAS44406-6、转基因棉花GHB614和转基因玉米HCEM485等共13个转化体已批准商业化应用（LEPPINGetal.,2013;http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/gene/default.asp?GeneID=22&Gene=2mepsps）。图1-2大肠杆菌EPSPS三维结构图（KREKELetal.,1999）Fig.1-2Three-dimensionalstructureofE.ColiEPSPS（KREKELetal.,1999）I,II：EPSPS的两个结构域，G96：EPSPS中第96个甘氨酸，是与草甘膦结合?
解草甘膦的细菌（FORLANIetal.,1999）。早在1977年，Nomura和Hilton就分离到了降解草甘膦的细菌菌株（NOMURA&HILTO,1977），目前已报道的具有草甘膦降解活性的细菌包括假单胞菌、黄杆菌、节杆菌和肺炎克氏杆菌等（朱玉等，2003）。已知草甘膦的降解途径有两种，一种是通过C-N键断裂形成氨甲基膦酸（AminomethylPhosphonicAcid,AMPA）和乙醛酸，另一种途径是通过C-P键断裂生成肌氨酸（SHINABARGERetal.,1986;TALBOTetal.,1984），这些中间代谢产物物进而代谢成为二氧化碳、磷酸和甘氨酸等，从而为微生物提供碳源、磷源和氮源（图1-3）。在1992年，Barry等分离克隆到了草甘膦氧化还原酶基因gox，此基因能将草甘膦降解为AMPA（BARRYetal.,1992）。1995年，Penalaza-Vazquez等从能降解草甘膦的类鼻祖假单胞菌（Pseudomonaspseddomallei）中克隆了草甘膦降解基因glpA和glpB，这两个基因能赋予大肠杆菌降解草甘膦的能力。草甘膦氧化还原酶基因goxv247来源于人人苍白杆菌菌株LBAA，能够将草甘膦降解为AMPA和乙醛酸，将此基因导入作物中能赋予转基因作物耐受草甘膦的能力，目前商业化应用的耐草甘膦转基因油菜GT73、转基因玉米Mon810和转基因甜菜GTSB77中均含有此基因。图1-3草甘膦降解途径（顿宝庆，2007）Fig.1-3Glyphosatedegradationpathway（顿宝庆，2007）1.1.2.4草甘膦N-乙酰化途径草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosaten-acetyltransferase,GAT）基因（gat），表达的GAT能够催化一个转乙酰基的反应，将乙酰辅酶A（CoA）上的羧基基团转移至草甘膦的亚氨基上，生成无毒的N-乙酰草甘膦，从而解除其毒性（图1-4）。Castle等2004年从地衣芽胞杆菌中筛选出了gat基因，并通过DNAshuffling技术进行突变，获得了编码高活性的草甘膦N-乙酰转移酶gat基因，这些g
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications China Biotechnology;. 中国生物工程杂志. 2019(08)
[2]耐草甘膦杂草的研究现状[J]. 贾芳,崔海兰,李香菊,于惠林. 杂草学报. 2019(01)
[3]利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究[J]. 董玉凤,王旭静,宋亚亚,靳茜,王志兴. 作物学报. 2019(03)
[4]全球抗除草剂转基因作物转化事件分析[J]. 王园园,王敏,相世刚,刘琪,强胜,宋小玲. 农业生物技术学报. 2018(01)
[5]转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探[J]. 陆国清,王春玲,郝宇琼,郭惠明,黄英金,程红梅. 棉花学报. 2018(01)
[6]草甘膦作用机制和抗性研究进展[J]. 陈世国,强胜,毛婵娟. 植物保护. 2017(02)
[7]复合性状转基因水稻B2A68在南京地区杂草化的风险评估[J]. 黄鹞,王建,戴伟民,强胜,肖国樱,宋小玲. 杂草科学. 2014(01)
[8]转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定[J]. 王霞,马燕斌,吴霞,沈志成,林朝阳,李朋波,孙璇,王新胜,李燕娥,李贵全. 中国农业科学. 2014(06)
[9]转基因耐除草剂作物的环境风险及管理[J]. 李云河,彭于发,李香菊,吴孔明. 植物学报. 2012(03)
[10]抗除草剂转基因作物面临的机遇与挑战及其发展策略[J]. 强胜,宋小玲,戴伟民. 农业生物技术学报. 2010(01)
博士论文
[1]转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析[D]. 董玉凤.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]转G10evo和ZmTE1基因抗草甘膦高产玉米的研究[D]. 刘苗苗.浙江大学 2017
[2]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
[3]可变盐单胞菌EPSPS基因的突变和抗草甘膦玉米的培育[D]. 靳传娣.山东大学 2016
本文编号：3258790
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
莽草酸合成途径和草甘膦作用位点（GOMESetal.,2014）
016），目前转G10-aroA基因的玉米已于2020年1月获得安全证书，具有良好的应用前景。来源于荧光假单胞菌G2菌株的G2-aroA基因，能够赋予转基因水稻、玉米、大豆、棉花、烟草和油菜等耐受草甘膦的能力（ZHANGetal.,2015;DONGetal.,2017;GUOetal.,2015;DUNetal.,2007;WANGetal.,2014），利用G2-aroA基因培育的转基因玉米已进入安全证书申报阶段。1.1.2.2EPSPS基因突变EPSP合酶第90-120氨基酸区段为与草甘膦的结合区，其中第96位的甘氨酸是与草甘膦结合的活性位点，另外，第123-134、140-152和355-367肽段也与草甘膦的结合有关（图1-2）（PADGETTetal.,1991;KREKELetal.,1999）。因此，这些区段的单一或多个氨基酸发生突变，会使得EPSPS与草甘膦的结合活性降低，具有草甘膦抗性。靳传娣利用重叠延伸法对来源于可变盐单胞菌（Halomonasvarabilis）的EPSPS基因（H.Var-EPSPS）进行突变，获得了S99A和G100A双突变的H.Var-EPSPS基因，将突变基因导入玉米后培育出了耐受草甘膦的转基因玉米植株（靳传娣，2016）。Lebrun等利用定点突变技术对玉米的EPSPS基因进行突变，获得了102位（用异亮氨酸代替苏氨酸）和106位（用丝氨酸代替脯氨酸)突变的双突变基因2mepsps（LEBRUNetal.,1997），将基因导入棉花、大豆、玉米后，获得了耐受草甘膦的转基因植株，含有2mepsps的转基因大豆DAS44406-6、转基因棉花GHB614和转基因玉米HCEM485等共13个转化体已批准商业化应用（LEPPINGetal.,2013;http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/gene/default.asp?GeneID=22&Gene=2mepsps）。图1-2大肠杆菌EPSPS三维结构图（KREKELetal.,1999）Fig.1-2Three-dimensionalstructureofE.ColiEPSPS（KREKELetal.,1999）I,II：EPSPS的两个结构域，G96：EPSPS中第96个甘氨酸，是与草甘膦结合?
解草甘膦的细菌（FORLANIetal.,1999）。早在1977年，Nomura和Hilton就分离到了降解草甘膦的细菌菌株（NOMURA&HILTO,1977），目前已报道的具有草甘膦降解活性的细菌包括假单胞菌、黄杆菌、节杆菌和肺炎克氏杆菌等（朱玉等，2003）。已知草甘膦的降解途径有两种，一种是通过C-N键断裂形成氨甲基膦酸（AminomethylPhosphonicAcid,AMPA）和乙醛酸，另一种途径是通过C-P键断裂生成肌氨酸（SHINABARGERetal.,1986;TALBOTetal.,1984），这些中间代谢产物物进而代谢成为二氧化碳、磷酸和甘氨酸等，从而为微生物提供碳源、磷源和氮源（图1-3）。在1992年，Barry等分离克隆到了草甘膦氧化还原酶基因gox，此基因能将草甘膦降解为AMPA（BARRYetal.,1992）。1995年，Penalaza-Vazquez等从能降解草甘膦的类鼻祖假单胞菌（Pseudomonaspseddomallei）中克隆了草甘膦降解基因glpA和glpB，这两个基因能赋予大肠杆菌降解草甘膦的能力。草甘膦氧化还原酶基因goxv247来源于人人苍白杆菌菌株LBAA，能够将草甘膦降解为AMPA和乙醛酸，将此基因导入作物中能赋予转基因作物耐受草甘膦的能力，目前商业化应用的耐草甘膦转基因油菜GT73、转基因玉米Mon810和转基因甜菜GTSB77中均含有此基因。图1-3草甘膦降解途径（顿宝庆，2007）Fig.1-3Glyphosatedegradationpathway（顿宝庆，2007）1.1.2.4草甘膦N-乙酰化途径草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosaten-acetyltransferase,GAT）基因（gat），表达的GAT能够催化一个转乙酰基的反应，将乙酰辅酶A（CoA）上的羧基基团转移至草甘膦的亚氨基上，生成无毒的N-乙酰草甘膦，从而解除其毒性（图1-4）。Castle等2004年从地衣芽胞杆菌中筛选出了gat基因，并通过DNAshuffling技术进行突变，获得了编码高活性的草甘膦N-乙酰转移酶gat基因，这些g
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications China Biotechnology;. 中国生物工程杂志. 2019(08)
[2]耐草甘膦杂草的研究现状[J]. 贾芳,崔海兰,李香菊,于惠林. 杂草学报. 2019(01)
[3]利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究[J]. 董玉凤,王旭静,宋亚亚,靳茜,王志兴. 作物学报. 2019(03)
[4]全球抗除草剂转基因作物转化事件分析[J]. 王园园,王敏,相世刚,刘琪,强胜,宋小玲. 农业生物技术学报. 2018(01)
[5]转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探[J]. 陆国清,王春玲,郝宇琼,郭惠明,黄英金,程红梅. 棉花学报. 2018(01)
[6]草甘膦作用机制和抗性研究进展[J]. 陈世国,强胜,毛婵娟. 植物保护. 2017(02)
[7]复合性状转基因水稻B2A68在南京地区杂草化的风险评估[J]. 黄鹞,王建,戴伟民,强胜,肖国樱,宋小玲. 杂草科学. 2014(01)
[8]转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定[J]. 王霞,马燕斌,吴霞,沈志成,林朝阳,李朋波,孙璇,王新胜,李燕娥,李贵全. 中国农业科学. 2014(06)
[9]转基因耐除草剂作物的环境风险及管理[J]. 李云河,彭于发,李香菊,吴孔明. 植物学报. 2012(03)
[10]抗除草剂转基因作物面临的机遇与挑战及其发展策略[J]. 强胜,宋小玲,戴伟民. 农业生物技术学报. 2010(01)
博士论文
[1]转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析[D]. 董玉凤.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]转G10evo和ZmTE1基因抗草甘膦高产玉米的研究[D]. 刘苗苗.浙江大学 2017
[2]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
[3]可变盐单胞菌EPSPS基因的突变和抗草甘膦玉米的培育[D]. 靳传娣.山东大学 2016
本文编号：3258790
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