他克莫司生物合成相关基因研究及其产生菌遗传改造

发布时间：2021-07-06 12:08

　　他克莫司（FK506）是由链霉菌产生的一种23元大环内酯类免疫抑制剂,是肝和肾等器官移植后抗排斥反应的一线用药,已在多个国家上市。然而作为一种微生物的发酵产物,FK506存在效价低、副产物多等问题。因此,通过研究其产生菌中影响FK506生物合成的相关基因,能够为通过基因工程改善该菌的发酵特性、降低生产成本等创造有利条件。本研究以链霉菌Streptomyces sp.TL01为出发菌株,研究了FK506生物合成及其转录调控因子编码基因、次级代谢相关基因以及外源的颤血红蛋白编码基因分别对菌株发酵和代谢产物生物合成的影响。以LuxR家族的转录调控因子编码基因fkbN, LysR家族的转录调控因子编码基因tcs7,初级代谢途径中参与合成或消耗NADPH的酶编码基因zwf2和gltD,催化乙酰CoA生成丙二酰CoA的酶编码基因bccA2,催化他克莫司生物合成后修饰的C31位氧甲基化酶编码基因fkbM,及用于提高菌株氧结合水平的颤血红蛋白编码基因vgb等作为目标基因,借助分子生物学的手段,通过酶切酶连完成重组质粒构建后,经大肠杆菌-链霉菌的属间接合转移,将构建好的质粒导入到受体菌Streptomy... 

【文章来源】：福建中医药大学福建省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 材料与方法
    1 材料、试剂和仪器
        1.1 菌种
        1.2 质粒
        1.3 PCR引物
        1.4 培养基
        1.5 试剂
        1.6 仪器和设备
    2 实验方法
        2.1 菌种的分离纯化
        2.2 FK506发酵和液相分析
        2.3 菌种保藏
        2.4 抗生素敏感性实验
        2.5 链霉菌基因组DNA的提取
        2.6 PCR反应体系和程序
        2.7 琼脂糖凝胶电泳
        2.8 DNA片段的胶回收和PCR纯化
        2.9 大肠杆菌质粒的提取
        2.10 DNA酶切、去磷酸化和酶连
        2.11 大肠杆菌质粒转化
        2.12 大肠杆菌-链霉菌属间接合转移
        2.13 敲除菌株的筛选
        2.14 PCR验证
第二章 转录调控因子编码基因对FK506合成的影响研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物设计
        1.2 PCR扩增
        1.3 质粒构建
        1.4 工程菌构建
    2 发酵与液相分析
        2.1 fkbN改造菌株的发酵和液相分析
        2.2 tcs7改造菌株的发酵和液相分析
    3 讨论
第三章 初级代谢基因对FK506合成的影响研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物设计
        1.2 PCR扩增
        1.3 质粒构建
        1.4 工程菌构建
    2 发酵与液相分析
        2.1 zwf2、6ccA2基因增加拷贝数工程菌株的发酵和液相分析
        2.2 gltD改造菌株的发酵和液相分析
    3 讨论
第四章 FK506生物合成基因的功能研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物设计
        1.2 PCR扩增
        1.3 质粒构建
        1.4 工程菌构建
    2 发酵与液相分析
        2.1 fkbM基因增加拷贝数工程菌株的发酵和液相分析
    3 讨论
第五章 外源颤血红蛋白基因对他克莫司产生菌生长影响
    1 基因改造
        1.1 质粒构建
        1.2 工程菌构建
    2 发酵分析
    3 讨论
第六章 结论
    1 转录调控因子编码基因对FK506合成的影响研究
    2 初级代谢基因对FK506合成的影响研究
    3 FK506生物合成基因的功能研究
    4 外源颤血红蛋白基因对他克莫司产生菌生长影响
    5 讨论与展望
参考文献
致谢
文献综述
    1 他克莫司产生菌
    2 他克莫司生物合成机制
        2.1 骨架的合成
        2.2 特殊前体的合成
        2.3 结构后修饰
    3 他克莫司发酵营养学与菌种改造
        3.1 合成前体物对发酵水平的影响
        3.2 遗传改造
    4 发酵产物纯化
    5 总结和展望
    参考文献
作者简历



本文编号：3268214