外源基因在银耳芽孢中的高效表达体系研究及应用
发布时间：2021-07-29 16:29
银耳芽孢是银耳（Tremella fuciformis）担孢子芽殖产生的酵母状分生孢子,可通过芽殖方式无限繁殖,且生长快速、易于培养与转化,具备作为生物反应器的潜质。目前已有多种基因在银耳芽孢中表达成功,但是表达量偏低,缺乏安全有效的抗性筛选标记,表达体系尚不完善;目前实验室已在银耳芽孢中成功获得rfp基因的表达,但是HIV-TAT-survivin（T34A）突变体基因（TAT-survivin（T34A））未表达成功。为改善这些问题,本研究以PNP（经酵母表达载体pPICZA改造而成）为表达载体,以lacZ基因为报告基因,通过替换外源基因表达启动子的方法构建银耳芽孢外源基因表达载体,通过比较β-半乳糖苷酶活性筛选最佳启动子,采用该启动子构建rfp基因与TAT-survivin（T34A）的融合表达载体表达TAT-survivin（T34A）蛋白。具体内容与结果如下:1.外源基因表达载体、筛选标记与转化方法的选择通过比较pCAMBIA1301、PNP载体的转化效果以及潮霉素B、zeocinTM抗生素筛选效果,发现银耳芽孢对zeocinTM敏感,最低筛选浓度为25μg·mL-1 PNP...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－５?ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体菌液ＰＣＲ验证结果??Ｆｉｇ．?１－５?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ??
１４／ａｃＺ基因的扩增电泳?１－４?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｌａｃＺ?ａｒｋｅｒ；泳道１：?／％Ｚ基５?４?３?２?１?Ｍ???５０３０ＮＰ－ｌａｃＺ载体菌液ＰＣＲ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ１－６：?ＰＮＰ－ｌａｃＺ阳性克隆以通用引物３’ＡＯＸ丨
?２６００?３２５０??图１－７测序结果ＮＣＢＩ在线比对分析结果??Ｆｉｇ．?１－７?ＮＣＢＩ?Ｂｌａｓｔ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ??３．６重组质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ转化银耳芽孢结果??重组质粒转化银耳芽孢的结果显示，转入质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ的实验组从第７天??开始长出转化子，到第１２天左右基本全部长出（如图１－８?ｃ）；未转入质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ??的对照组１涂布到含有５０?ｐｇ?ｍＬ－１?ｚｅｏｃｉｎ？的ＣＭ平板上，直到第１５?ｄ未发现有??任何菌落长出（如图１－８?ａ）；而涂布到不含任何抗生素的平板上的对照组２则??菌落长满了平板（如图１－８?ｂ），对照组２菌落从第５天开始陆续长出，这一时??间要早于实验组转化子长出的时间，但是要比未处理过得银耳芽孢的生长速度??慢。这或许是因为电击转化处理过后银耳芽孢需要一段时间的复苏才开始生长繁??殖。转化结果表明，采用ｚｅｏｃｉｎ抗性基因筛选标记，通过电击转化法可以有效地??获得银耳芽孢的转化子。??■０１圓??图１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体转化银耳芽孢??Ｆｉｇ．?１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｔ．?ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ?ｙｅａｓｔ－ｌｉｋｅ?ｃｏｎｉｄｉａ??ａ：对照组１?（不转质粒转化，涂布ｚｅｏｃｉｎ抗生素平板）；ｂ：对照组２?（不转质粒转化，涂??布不含抗生素平板）；ｃ：电击转入ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体后长出的菌落??３．７重组质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ转化子鉴定结果??随机挑取６个拟转化子
【参考文献】：
期刊论文
[1]银耳工厂化周年生产技术[J]. 倪凯,戴义曦. 食药用菌. 2017(06)
[2]凋亡抑制因子Survivin的研究进展[J]. 刘馨莲,綦黄鹏,魏仙. 中外医学研究. 2017(20)
[3]浅析古田银耳产业的发展[J]. 刘方明. 木工机床. 2017(02)
[4]草菇电击法遗传转化的研究[J]. 吕贝贝,于海龙,蒋玮,吴潇,武国干,赵妍,陈蕾,唐雪明. 上海农业学报. 2017(03)
[5]银耳工厂化栽培关键技术研究[J]. 蔡丹凤,蔡志欣,郑朋武. 中国食用菌. 2017(03)
[6]银耳工厂化瓶栽生产工艺试验[J]. 黄勇云,雷德赐,杨彬,罗竟通,陈典灿,卞威. 食用菌. 2017(01)
[7]抗肿瘤抗生素博来霉素的研究进展[J]. 谢新宇,王晶珂,邓佩佩,郑学丽,钱思宇,李敏. 煤炭与化工. 2016(03)
[8]工厂化栽培银耳配方筛选[J]. 张莉,常明昌,孟俊龙,元玲刚,申永乐,李武辉. 山西农业科学. 2016(02)
[9]红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定[J]. 阮玲云,翁彩红,陈世友,陈文星,赖春芬,艾柳英,胡开辉,孙淑静. 热带作物学报. 2015(10)
[10]银耳工厂化栽培及其生产工艺探讨[J]. 张莉,常明昌,孟俊龙,元玲刚,刘靖宇,李武辉. 中国食用菌. 2015(04)
博士论文
[1]灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究[D]. 赵霏.兰州大学 2016
[2]银耳生物反应器的基础研究[D]. 孙淑静.福建农林大学 2008
[3]小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究[D]. 王逸云.大连理工大学 2006
[4]银耳遗传转化系统的建立及三个品质基因的转化[D]. 谢宝贵.福建农林大学 2004
硕士论文
[1]疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建[D]. 韩华.山东农业大学 2012
[2]菌草栽培银耳工艺的研究与应用[D]. 黄玉琴.福建农林大学 2012
[3]链霉菌769遗传转化体系的建立和优化[D]. 张红丹.吉林农业大学 2011
[4]不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物[D]. 张文瑞.福建农林大学 2011
[5]银耳遗传转化受体菌株筛选及其发酵条件研究[D]. 陈东兴.福建农林大学 2009
[6]高赖氨酸蛋白基因转化银耳研究[D]. 朱虎.福建农林大学 2004
本文编号：3309664
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－５?ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体菌液ＰＣＲ验证结果??Ｆｉｇ．?１－５?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ??
１４／ａｃＺ基因的扩增电泳?１－４?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｌａｃＺ?ａｒｋｅｒ；泳道１：?／％Ｚ基５?４?３?２?１?Ｍ???５０３０ＮＰ－ｌａｃＺ载体菌液ＰＣＲ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ１－６：?ＰＮＰ－ｌａｃＺ阳性克隆以通用引物３’ＡＯＸ丨
?２６００?３２５０??图１－７测序结果ＮＣＢＩ在线比对分析结果??Ｆｉｇ．?１－７?ＮＣＢＩ?Ｂｌａｓｔ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ??３．６重组质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ转化银耳芽孢结果??重组质粒转化银耳芽孢的结果显示，转入质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ的实验组从第７天??开始长出转化子，到第１２天左右基本全部长出（如图１－８?ｃ）；未转入质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ??的对照组１涂布到含有５０?ｐｇ?ｍＬ－１?ｚｅｏｃｉｎ？的ＣＭ平板上，直到第１５?ｄ未发现有??任何菌落长出（如图１－８?ａ）；而涂布到不含任何抗生素的平板上的对照组２则??菌落长满了平板（如图１－８?ｂ），对照组２菌落从第５天开始陆续长出，这一时??间要早于实验组转化子长出的时间，但是要比未处理过得银耳芽孢的生长速度??慢。这或许是因为电击转化处理过后银耳芽孢需要一段时间的复苏才开始生长繁??殖。转化结果表明，采用ｚｅｏｃｉｎ抗性基因筛选标记，通过电击转化法可以有效地??获得银耳芽孢的转化子。??■０１圓??图１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体转化银耳芽孢??Ｆｉｇ．?１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｔ．?ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ?ｙｅａｓｔ－ｌｉｋｅ?ｃｏｎｉｄｉａ??ａ：对照组１?（不转质粒转化，涂布ｚｅｏｃｉｎ抗生素平板）；ｂ：对照组２?（不转质粒转化，涂??布不含抗生素平板）；ｃ：电击转入ＰＮＰ－ｌａｃＺ载体后长出的菌落??３．７重组质粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ转化子鉴定结果??随机挑取６个拟转化子
【参考文献】：
期刊论文
[1]银耳工厂化周年生产技术[J]. 倪凯,戴义曦. 食药用菌. 2017(06)
[2]凋亡抑制因子Survivin的研究进展[J]. 刘馨莲,綦黄鹏,魏仙. 中外医学研究. 2017(20)
[3]浅析古田银耳产业的发展[J]. 刘方明. 木工机床. 2017(02)
[4]草菇电击法遗传转化的研究[J]. 吕贝贝,于海龙,蒋玮,吴潇,武国干,赵妍,陈蕾,唐雪明. 上海农业学报. 2017(03)
[5]银耳工厂化栽培关键技术研究[J]. 蔡丹凤,蔡志欣,郑朋武. 中国食用菌. 2017(03)
[6]银耳工厂化瓶栽生产工艺试验[J]. 黄勇云,雷德赐,杨彬,罗竟通,陈典灿,卞威. 食用菌. 2017(01)
[7]抗肿瘤抗生素博来霉素的研究进展[J]. 谢新宇,王晶珂,邓佩佩,郑学丽,钱思宇,李敏. 煤炭与化工. 2016(03)
[8]工厂化栽培银耳配方筛选[J]. 张莉,常明昌,孟俊龙,元玲刚,申永乐,李武辉. 山西农业科学. 2016(02)
[9]红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定[J]. 阮玲云,翁彩红,陈世友,陈文星,赖春芬,艾柳英,胡开辉,孙淑静. 热带作物学报. 2015(10)
[10]银耳工厂化栽培及其生产工艺探讨[J]. 张莉,常明昌,孟俊龙,元玲刚,刘靖宇,李武辉. 中国食用菌. 2015(04)
博士论文
[1]灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究[D]. 赵霏.兰州大学 2016
[2]银耳生物反应器的基础研究[D]. 孙淑静.福建农林大学 2008
[3]小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究[D]. 王逸云.大连理工大学 2006
[4]银耳遗传转化系统的建立及三个品质基因的转化[D]. 谢宝贵.福建农林大学 2004
硕士论文
[1]疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建[D]. 韩华.山东农业大学 2012
[2]菌草栽培银耳工艺的研究与应用[D]. 黄玉琴.福建农林大学 2012
[3]链霉菌769遗传转化体系的建立和优化[D]. 张红丹.吉林农业大学 2011
[4]不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物[D]. 张文瑞.福建农林大学 2011
[5]银耳遗传转化受体菌株筛选及其发酵条件研究[D]. 陈东兴.福建农林大学 2009
[6]高赖氨酸蛋白基因转化银耳研究[D]. 朱虎.福建农林大学 2004
本文编号：3309664
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3309664.html
最近更新
教材专著
