应用基因编辑技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究
发布时间：2021-08-01 14:32
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）是一类广泛的存在于植物、动物和微生物中,并且结构复杂的含铜氧化还原酶。在果蔬褐变过程中发挥重要作用。当果蔬受到机械损伤后,多酚氧化酶在氧气存在的情况下催化酚类化合物转化为醌,醌再与氨基酸、蛋白质和酚类物质进行聚合反应形成褐色的聚合物,从而导致果蔬因酶促褐变造成重大损失。本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9分别对主要存在于马铃薯块茎中的多酚氧化酶基因POT32和POT33进行编辑,以期降低马铃薯块茎受机械损伤引发褐变发生率,获得抗褐化马铃薯新种质。该研究对减少果蔬褐变从而提高经济效益,创制抗褐化种质资源有重大意义。研究取得的主要研究结果如下:1、成功构建靶点特异性gRNA/Cas9植物表达载体并遗传转化马铃薯本实验以马铃薯大西洋品种作为实验材料,根据靶点设计要求构建靶点特异性gRNA/Cas9植物表达载体,POT32和POT33基因各两个靶点,分别记作SG5797、SG5798、SG5799和G5800,采用拟南芥U6启动子启动gRNA,并采用加强型CaMV35启动子高效表达Cas9蛋白,同时表达潮霉素抗性基因。通过农杆菌...
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
马铃薯酶促褐变机理（张学杰等，2000）
2010 ）。核酸酶(ZFNs)基本结构和作用原理(ZFNs)是一种经人工合成的锌指核酸酶,包括 N 端和 C 端。N 端是由NA 序列的锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)结构域，C 端是由 Fok I 其中锌指(zinc finger, ZF)是 ZFP 结构域构成的基本单位，并且 ZF 广，还能介导蛋白质与核酸、小分子物质或者其它蛋白质之间特异性的10)。ZFP 结构域通常由 3-6 个锌指的重复单位经过串联构成，并且与控相关，其中每个锌指能够直接特异性的识别 DNA 双链中其中一条个核苷酸序列，通过将多个锌指串联组成的 ZFP 结构域能够识别更多也增强 DNA 靶向修饰的特异性(Kim et al., 1996;钟强和赵书红,2010)
并且在两个结合位点间（5-7 bp）发生切割，引起 DNA 双键出现断裂 (Miller et al.,985; Wolfe et al., 2000)如图 2(Porteus et al., 2005)，从而导致同源重组或者非同源末端连对双链的修复，修复过程存在自发错误以及人为引入的变化，从而对基因组 DNA 序引发改变，实现基因定点的突变目的。.5.2 类转录激活因子效应物核酸酶基本结构和作用原理转录激活因子效应物核酸酶(TALENs) 是经过人工改造的核酸内切酶，在结构上包括异性蛋白结合域以及非特异性的切割域两部分( Boch et al, 2009;Moscou et al., Moscout al., 2009)，TALEN 的切割域和 ZFN 的切割域类似，也是 Fok I 内切酶 ；TALEN 的合域是经过人工改造的 TALE 蛋白，TALE 蛋白源自于黄单胞杆菌（Xanthomonas）。 ZFN 相似，根据靶点位置两侧序列设计一对 TALEN，通过特异识别 DNA 序列后，个 Fok I 单体通过相互作用可形成二聚体，再对靶标序列进行切割从而进行基因修饰Boch J, 2011)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 黄小贞,曾晓芳,李建容,赵德刚. 农业生物技术学报. 2017(06)
[2]基于基因组编辑技术的水稻靶向突变特征及遗传分析[J]. 唐丽,李曜魁,张丹,毛毕刚,吕启明,胡远艺,韶也,彭彦,赵炳然,夏石头. 遗传. 2016(08)
[3]多酚氧化酶结构及褐变机理研究进展[J]. 刘芳,赵金红,朱明慧,甘芝霖,倪元颖. 食品研究与开发. 2015(06)
[4]不同产地新鲜紫色马铃薯中花色苷及总酚的含量测定[J]. 吴晓敏,韩利文,王希敏,陈维云,杨官娥,刘可春. 中国食物与营养. 2014(05)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]果蔬采后酶促褐变机理及影响褐变的因素研究进展[J]. 弓志青,王文亮. 中国食物与营养. 2012(02)
[7]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[8]锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用[J]. 钟强,赵书红. 遗传. 2011(02)
[9]反义PPO基因对马铃薯块茎褐化的影响[J]. 王清,黄惠英,马文芳,王蒂. 作物学报. 2007(11)
[10]果蔬酶促褐变机理及其抑制方法研究进展[J]. 乔方,黄晓钰,余海虎. 安徽农业科学. 2007(24)
博士论文
[1]采用人造小RNA技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 池明.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉马铃薯[D]. 潘京.内蒙古大学 2017
[2]马铃薯多酚氧化酶性质及抑制剂作用机理的研究[D]. 黄浩.厦门大学 2006
本文编号：3315700
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
马铃薯酶促褐变机理（张学杰等，2000）
2010 ）。核酸酶(ZFNs)基本结构和作用原理(ZFNs)是一种经人工合成的锌指核酸酶,包括 N 端和 C 端。N 端是由NA 序列的锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)结构域，C 端是由 Fok I 其中锌指(zinc finger, ZF)是 ZFP 结构域构成的基本单位，并且 ZF 广，还能介导蛋白质与核酸、小分子物质或者其它蛋白质之间特异性的10)。ZFP 结构域通常由 3-6 个锌指的重复单位经过串联构成，并且与控相关，其中每个锌指能够直接特异性的识别 DNA 双链中其中一条个核苷酸序列，通过将多个锌指串联组成的 ZFP 结构域能够识别更多也增强 DNA 靶向修饰的特异性(Kim et al., 1996;钟强和赵书红,2010)
并且在两个结合位点间（5-7 bp）发生切割，引起 DNA 双键出现断裂 (Miller et al.,985; Wolfe et al., 2000)如图 2(Porteus et al., 2005)，从而导致同源重组或者非同源末端连对双链的修复，修复过程存在自发错误以及人为引入的变化，从而对基因组 DNA 序引发改变，实现基因定点的突变目的。.5.2 类转录激活因子效应物核酸酶基本结构和作用原理转录激活因子效应物核酸酶(TALENs) 是经过人工改造的核酸内切酶，在结构上包括异性蛋白结合域以及非特异性的切割域两部分( Boch et al, 2009;Moscou et al., Moscout al., 2009)，TALEN 的切割域和 ZFN 的切割域类似，也是 Fok I 内切酶 ；TALEN 的合域是经过人工改造的 TALE 蛋白，TALE 蛋白源自于黄单胞杆菌（Xanthomonas）。 ZFN 相似，根据靶点位置两侧序列设计一对 TALEN，通过特异识别 DNA 序列后，个 Fok I 单体通过相互作用可形成二聚体，再对靶标序列进行切割从而进行基因修饰Boch J, 2011)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 黄小贞,曾晓芳,李建容,赵德刚. 农业生物技术学报. 2017(06)
[2]基于基因组编辑技术的水稻靶向突变特征及遗传分析[J]. 唐丽,李曜魁,张丹,毛毕刚,吕启明,胡远艺,韶也,彭彦,赵炳然,夏石头. 遗传. 2016(08)
[3]多酚氧化酶结构及褐变机理研究进展[J]. 刘芳,赵金红,朱明慧,甘芝霖,倪元颖. 食品研究与开发. 2015(06)
[4]不同产地新鲜紫色马铃薯中花色苷及总酚的含量测定[J]. 吴晓敏,韩利文,王希敏,陈维云,杨官娥,刘可春. 中国食物与营养. 2014(05)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]果蔬采后酶促褐变机理及影响褐变的因素研究进展[J]. 弓志青,王文亮. 中国食物与营养. 2012(02)
[7]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[8]锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用[J]. 钟强,赵书红. 遗传. 2011(02)
[9]反义PPO基因对马铃薯块茎褐化的影响[J]. 王清,黄惠英,马文芳,王蒂. 作物学报. 2007(11)
[10]果蔬酶促褐变机理及其抑制方法研究进展[J]. 乔方,黄晓钰,余海虎. 安徽农业科学. 2007(24)
博士论文
[1]采用人造小RNA技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 池明.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉马铃薯[D]. 潘京.内蒙古大学 2017
[2]马铃薯多酚氧化酶性质及抑制剂作用机理的研究[D]. 黄浩.厦门大学 2006
本文编号：3315700
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3315700.html
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