犬细小病毒VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性鉴定

发布时间：2021-08-06 06:23

　　犬细小病毒病是一种由犬细小病毒（Canine Parvovirus virus,CPV）引起的犬类动物的高度接触性传染性疾病。犬细小病毒病从发现至今一直在我国不同省市地区广泛流行,给我国的养犬业和宠物业造成不同程度的经济损失。一直以来接种疫苗是控制CPV流行的关键,但随着毒株的不断变异,对CPV的防控更加困难,因此研制安全高效的CPV疫苗对预防我国犬细小病毒病的流行具有重大的意义。本研究首先通过PCR扩增得到了CPV主要抗原VP2基因片段,经过酶切鉴定和测序分析,确定所得VP2片段无碱基缺失或插入,将VP2片段克隆至本实验室建立的杆状病毒多基因表达系统中进行CPV-VP2蛋白的表达,同时为了优化VP2蛋白的表达量构建了一系列重组杆状病毒p YBDM-IM-polh-VP2、p YBDM-IM-p10-VP2和p YBDM-IM-polh-VP2-p10-VP2。重组病毒携带的m Cherry红色荧光蛋白基因,将重组病毒感染Sf9昆虫细胞后可以在荧光显微镜下观察到红色荧光。收集细胞的培养液上清进行基因组DNA的提取,根据VP2的特异性引物进行PCR鉴定,结果显示成功扩增出1750 bp左... 

【文章来源】：南阳师范学院河南省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 综述
    1.1 病原
        1.1.1 CPV生物学特性
        1.1.2 CPV基因组结构
        1.1.3 主要蛋白VP2结构与功能
        1.1.4 CPV的起源和进化
    1.2 CPV致病机理与流行病学
        1.2.1 CPV致病机理
        1.2.2 CPV流行病学
    1.3 CPV的诊断和预防
        1.3.1 CPV的诊断
        1.3.2 CPV的预防
    1.4 杆状病毒表达系统作为表达工具的基因工程疫苗的发展
2 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株、质粒、病毒、细胞、小白鼠
        2.1.2 相关试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验室常用试剂配制
        2.2.1 细菌培养基的配制
        2.2.2 昆虫细胞Grace培养基的配制
        2.2.3 抗生素配制与相关试剂
        2.2.4 核酸电泳相关试剂配制方法
        2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂
        2.2.6 蛋白免疫印迹所需试剂
        2.2.7 蛋白纯化试剂
    2.3 分子生物学基本操作
        2.3.1 质粒的提取
        2.3.2 琼脂糖凝胶电泳和回收
        2.3.3 PCR溶液回收
        2.3.4 感受态细胞制备方法
        2.3.5 大肠杆菌Top10转化
        2.3.6 菌种的保存
    2.4 昆虫细胞培养基本操作
        2.4.1 细胞复苏
        2.4.2 细胞传代
        2.4.3 细胞冻存
        2.4.4 细胞计数
    2.5 CPVVP2基因在杆状病毒表达系统中表达
        2.5.1 杆状病毒表达载体的构建
        2.5.2 转移载体的构建
    2.6 重组杆状病毒的构建
        2.6.1 Tn7转座
        2.6.2 侵染蛋白介导的经济高效生产感染性重组病毒粒子
        2.6.3 重组Bacmid菌液感染昆虫细胞
    2.7 重组病毒鉴定和滴度的测定
        2.7.1 提取病毒基因组
        2.7.2 制作病毒q-PCR曲线测定滴度
        2.7.3 终点稀释法测病毒滴度
    2.8 蛋白表达检测
        2.8.1 裂解细胞
        2.8.2 样品处理
        2.8.3 SDS-PAGE电泳
        2.8.4 WesternBlot检测蛋白表达
    2.9 表达蛋白的纯化和浓度测定
        2.9.1 蛋白纯化
        2.9.2 标签ELISA检测试剂盒测定蛋白浓度
    2.10 动物实验
        2.10.1 动物分组
        2.10.2 抗原的制备
        2.10.3 疫苗注射
        2.10.4 免疫效果检测
3 结果与分析
    3.1 CPVVP2基因的扩增和T载体克隆
        3.1.1 19T-VP2菌液PCR鉴定
        3.1.2 19T-VP2酶切鉴定
    3.2 VP2基因测序
    3.3 重组转移载体酶切鉴定
        3.3.1 转移载体pYBDM-IM-p10VP
        3.3.2 转移载体pYBDM-IM-phVP
        3.3.3 转移载体pYBDM-IM-p10VP2-phPV
    3.4 重组Bacmid菌液PCR鉴定
    3.5 重组杆状病毒基因组DNA的PCR验证
    3.6 细胞荧光和病毒滴度
        3.6.1 细胞荧光检测
        3.6.2 终点稀释法测定重组病毒滴度
        3.6.3 制作q-PCR标准曲线测定病毒滴度
    3.7 CPVVP2蛋白检测
        3.7.1 CPVVP2蛋白小量表达SDS-PAGE检测
        3.7.2 CPVVP2蛋白WesternBlot检测
        3.7.3 His标签ELISA检测试剂盒检测蛋白含量
    3.8 CPVVP2蛋白纯化
        3.8.1 CPVVP2蛋白纯化结果
        3.8.2 纯化蛋白的WesternBlot鉴定
    3.9 CPVVP2蛋白免疫原性检测结果
4 讨论
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]犬细小病毒病实验室诊断方法研究进展[J]. 孙亚茹,王建科,林鹏,程世鹏.  经济动物学报. 2018(01)
[2]犬细小病毒分子生物学研究进展[J]. 张玉香,李改茹,纪森林,檀济敏,王茹怡,粟硕.  中国预防兽医学报. 2016(12)
[3]犬细小病毒病毒样颗粒的研究进展[J]. 陈进会,刘国庆,颜其贵,陈珍容.  检验检疫学刊. 2016(04)
[4]犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[J]. 毛倩倩,周灵,唐青海,卜宾,唐存多,焦铸锦,姚伦广,阚云超,杨建伟,崔尚金.  中国畜牧兽医. 2016(07)
[5]犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析[J]. 卫巧林,张韵,甄士伟,殷相平.  中国畜牧兽医. 2016(04)
[6]昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用[J]. 梁璐琪.  畜禽业. 2014(10)
[7]犬细小病毒多重PCR检测方法的建立和临床应用[J]. 李涛,王高玲,王斌,修金生,胡崇伟,马金友.  黑龙江畜牧兽医. 2014(11)
[8]杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展[J]. 刘春菊,任炜杰,王志亮.  中国畜牧兽医. 2013(09)
[9]犬细小病毒:从起源到进化[J]. 赵建军,闫喜军,吴威.  微生物学报. 2011(07)
[10]中国国内首次检测到犬细小病毒CPV-2c[J]. 张仁舟,杨松涛,冯昊,崔苌盛,夏咸柱.  中国病原生物学杂志. 2010(04)

博士论文
[1]优化杆状病毒系统作为动物疫苗载体的研究[D]. 刘阳坤.西北农林科技大学 2015



本文编号：3325248