高产GABA乳酸菌的筛选鉴定、发酵优化及谷氨酸脱羧酶基因的分子改造
发布时间：2021-08-11 16:44
谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）,是能够将谷氨酸（Glutamate,L-glu）转化成 γ-氨基丁酸的唯一酶。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）,是生物体内广泛存在的一种非蛋白氨基酸,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静和预防老年痴呆等,因此,GABA在制药、食品、保健等行业存在巨大的应用潜能。目前,国内产GABA野生菌株能力较低,同时,在发酵生产过程中,GAD的最适pH偏低,普遍在4.0-5.0之间,当pH达到6.0时,酶就因解聚而失活,不利于工业应用。因此,为了得到能够高产GABA的菌株和拓宽GAD的pH适应范围,本研究从泡菜样品中筛选高产GABA的菌株,优化其发酵条件,同时在体外对GAD分子进行改造。主要研究内容和结果如下:1.高产GABA菌株的筛选鉴定。本研究以自贡地区的酸菜为样品,以乳酸菌产酸分解含有碳酸钙的MRS培养基形成溶钙圈为依据,初步筛选出乳酸菌,再通过TLC和HPLC法筛选出4株能够产GABA的菌株,对4株产GABA的菌株分别进行发酵培养,以产GABA的标准菌株CICC22144为对照...
【文章来源】：四川轻化工大学四川省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
E.coli中GABA的合成代谢途径（Figure1-1ThepathwayofGABAsynthesisandmetabolisminE.coli）[30]
四川轻化工大学硕士研究生学位论文~7~期的处理成本高、效果差，产品纯度往往达不到要求。所以，学者们对菌株的相关基因进行克隆表达，构建高效合成GABA的工程菌，以提高GABA的产量，用于食品及保健品的商业生产[55]。因此利用微生物发酵生产GABA，具有重要的商业价值，是目前的发展趋势。图1-2微生物合成GABA反应(Figure1-2TheGABAsynthesisbymicroorganisms)1.5研究的目的与意义γ-氨基丁酸作为一种功能因子，具有重要的生理功能。目前，国内微生物发酵产GABA菌株较少，产量也普遍较低，同时用于转化生成GABA的GAD的pH适应范围较窄，在工业应用中存在一定的局限性。为了进一步提高生物合成GABA的产量，本研究从传统发酵制品酸菜中筛选高产GABA的乳酸菌，随后对该高产菌株进行发酵条件优化，最大限度地发挥菌种的性能，同时对乳酸菌中生成GABA的关键限速酶---谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD），利用基因工程手段构建表达载体，在原核大肠杆菌中进行外源蛋白的可溶性表达，在此基础上，根据乳酸菌中GAD基因序列，与已知晶体结构的GAD蛋白进行同源建模，进行定点突变，拓宽该酶的反应pH，一方面得到高产耐中性或近中性环境的GABA的工程菌，另一方面为探索谷氨酸脱羧酶结晶条件，解析其空间三维结构，为高产GABA菌株工程改造奠定理论基矗1.6主要研究内容（1）高产GABA菌株的筛眩从酸菜、生牛乳等制品中通过薄层层析、高效液相色谱以及16SrDNA分子生物学方法，筛选鉴定一株高产GABA的乳酸菌。（2）对筛选出的乳酸菌进行发酵条件优化。初步探讨高产GABA乳酸菌的最适培养条件。（3）对乳酸菌中谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中实现可溶性表达。构建高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌工程菌，同时对GAD进行分离纯化，为进一步研究其酶?
四川轻化工大学硕士研究生学位论文~14~图3-1筛选单菌落（Figure3-1Screeningsinglecolony）通过薄层层析法，定性的检测乳酸菌产GABA。以一株产GABA的标准菌株CICC22144作为阳性对照，筛选得到4株产GABA的乳酸菌，分别编号为Liulab5、Liulab23、Liulab37和Liulab84。实验结果如图3-2所示。图3-2产GABA乳酸菌TLC结果（Figure3-2GABAProductionofLactobacillus）图注：1：GABA标准溶液；2：谷氨酸标准液；3：GABA与谷氨酸混合液4：Liulab5发酵液；5：Liulab23发酵液；6：Liulab37发酵液7：CICC22144发酵液；8：Liulab84发酵液为了定量的检测发酵液中GABA的含量，确定出高产菌株，利用高效液相色谱（HPLC）的方法进行检测。对标准样品进行高效液相色谱检测，得出标准曲线的R2值为0.9971，标准曲线有效。标准曲线见图3-3。以标准曲线为参考，分别检测发酵液上清中GABA含量，带入标准曲线中，得到各菌株产GABA的量见表3-1。检测结果表明，Liulab84菌株发酵产GABA的含量最高，达到1.92g/L。与标准菌株CICC22144相比，其含量更高，说明实验成功筛选出了一株高产GABA的野生乳酸菌菌株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]真空厌氧间歇技术富集福鼎大白茶茶鲜叶GABA的参数优化[J]. 沈强,许凡凡,张小琴,潘科,刘忠英,郑文佳. 食品工业科技. 2018(11)
[2]巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的表达及其酶活性研究[J]. 王一然,张俊帅,李家龙,刘素华,刘清岱,刘君,张泽生. 中国食品添加剂. 2017(08)
[3]谷氨酸脱羧酶基因工程改造研究进展[J]. 靳春鹏,杨套伟,徐美娟,张显,饶志明. 食品与发酵工业. 2016(12)
[4]谷氨酸和γ-氨基丁酸在帕金森病中的作用机制研究进展[J]. 朱燚,武衡. 现代医药卫生. 2015(21)
[5]马铃薯中γ-氨基丁酸富集技术研究[J]. 何秋云,杨志伟. 湖北农业科学. 2015(08)
[6]产γ-氨基丁酸乳酸菌及其应用[J]. 李理,刘冶,满朝新,姜毓君. 中国乳品工业. 2014(02)
[7]产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分离鉴定[J]. 韩雪,梁金钟. 食品工业科技. 2012(20)
[8]γ-氨基丁酸及其受体的研究进展[J]. 赵华颖,章劲夫. 中华临床医师杂志(电子版). 2012(14)
[9]Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究[J]. 张天萌,沐万孟,江波,张涛,倪靓霞. 食品与生物技术学报. 2012(03)
[10]γ-氨基丁酸对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠认知功能的影响[J]. 朱学芳,顾永健,陈芬. 中国老年学杂志. 2010(22)
硕士论文
[1]生产GABA乳酸菌的筛选及其相关特性研究[D]. 高晓彤.山东大学 2015
[2]短乳杆菌Lb85谷氨酸脱羧酶的分子改造及其γ-氨基丁酸的生物合成研究[D]. 谢一龙.江南大学 2014
[3]植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的异源表达及条件优化[D]. 莫征杰.浙江大学 2014
[4]产谷氨酸脱羧酶菌株筛选及生产γ-氨基丁酸的研究[D]. 邱文军.江南大学 2014
[5]大豆中γ-氨基丁酸富集及提取的研究[D]. 刘畅.东北农业大学 2013
[6]产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其功能性发酵酸奶的研制[D]. 贤乾隆.广西科技大学 2013
[7]大肠杆菌BL21（DE3）和MG1655的代谢特征比较[D]. 王欣然.山东大学 2012
[8]高效转化生产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌构建及其条件优化[D]. 田灵芝.江南大学 2012
[9]高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选鉴定、条件优化及谷氨酸脱羧酶基因的克隆[D]. 缪存影.浙江师范大学 2010
[10]乳酸菌菌株安全性的研究及优良酸奶发酵剂的筛选[D]. 冯大伟.华东理工大学 2010
本文编号：3336519
【文章来源】：四川轻化工大学四川省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
E.coli中GABA的合成代谢途径（Figure1-1ThepathwayofGABAsynthesisandmetabolisminE.coli）[30]
四川轻化工大学硕士研究生学位论文~7~期的处理成本高、效果差，产品纯度往往达不到要求。所以，学者们对菌株的相关基因进行克隆表达，构建高效合成GABA的工程菌，以提高GABA的产量，用于食品及保健品的商业生产[55]。因此利用微生物发酵生产GABA，具有重要的商业价值，是目前的发展趋势。图1-2微生物合成GABA反应(Figure1-2TheGABAsynthesisbymicroorganisms)1.5研究的目的与意义γ-氨基丁酸作为一种功能因子，具有重要的生理功能。目前，国内微生物发酵产GABA菌株较少，产量也普遍较低，同时用于转化生成GABA的GAD的pH适应范围较窄，在工业应用中存在一定的局限性。为了进一步提高生物合成GABA的产量，本研究从传统发酵制品酸菜中筛选高产GABA的乳酸菌，随后对该高产菌株进行发酵条件优化，最大限度地发挥菌种的性能，同时对乳酸菌中生成GABA的关键限速酶---谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD），利用基因工程手段构建表达载体，在原核大肠杆菌中进行外源蛋白的可溶性表达，在此基础上，根据乳酸菌中GAD基因序列，与已知晶体结构的GAD蛋白进行同源建模，进行定点突变，拓宽该酶的反应pH，一方面得到高产耐中性或近中性环境的GABA的工程菌，另一方面为探索谷氨酸脱羧酶结晶条件，解析其空间三维结构，为高产GABA菌株工程改造奠定理论基矗1.6主要研究内容（1）高产GABA菌株的筛眩从酸菜、生牛乳等制品中通过薄层层析、高效液相色谱以及16SrDNA分子生物学方法，筛选鉴定一株高产GABA的乳酸菌。（2）对筛选出的乳酸菌进行发酵条件优化。初步探讨高产GABA乳酸菌的最适培养条件。（3）对乳酸菌中谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中实现可溶性表达。构建高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌工程菌，同时对GAD进行分离纯化，为进一步研究其酶?
四川轻化工大学硕士研究生学位论文~14~图3-1筛选单菌落（Figure3-1Screeningsinglecolony）通过薄层层析法，定性的检测乳酸菌产GABA。以一株产GABA的标准菌株CICC22144作为阳性对照，筛选得到4株产GABA的乳酸菌，分别编号为Liulab5、Liulab23、Liulab37和Liulab84。实验结果如图3-2所示。图3-2产GABA乳酸菌TLC结果（Figure3-2GABAProductionofLactobacillus）图注：1：GABA标准溶液；2：谷氨酸标准液；3：GABA与谷氨酸混合液4：Liulab5发酵液；5：Liulab23发酵液；6：Liulab37发酵液7：CICC22144发酵液；8：Liulab84发酵液为了定量的检测发酵液中GABA的含量，确定出高产菌株，利用高效液相色谱（HPLC）的方法进行检测。对标准样品进行高效液相色谱检测，得出标准曲线的R2值为0.9971，标准曲线有效。标准曲线见图3-3。以标准曲线为参考，分别检测发酵液上清中GABA含量，带入标准曲线中，得到各菌株产GABA的量见表3-1。检测结果表明，Liulab84菌株发酵产GABA的含量最高，达到1.92g/L。与标准菌株CICC22144相比，其含量更高，说明实验成功筛选出了一株高产GABA的野生乳酸菌菌株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]真空厌氧间歇技术富集福鼎大白茶茶鲜叶GABA的参数优化[J]. 沈强,许凡凡,张小琴,潘科,刘忠英,郑文佳. 食品工业科技. 2018(11)
[2]巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的表达及其酶活性研究[J]. 王一然,张俊帅,李家龙,刘素华,刘清岱,刘君,张泽生. 中国食品添加剂. 2017(08)
[3]谷氨酸脱羧酶基因工程改造研究进展[J]. 靳春鹏,杨套伟,徐美娟,张显,饶志明. 食品与发酵工业. 2016(12)
[4]谷氨酸和γ-氨基丁酸在帕金森病中的作用机制研究进展[J]. 朱燚,武衡. 现代医药卫生. 2015(21)
[5]马铃薯中γ-氨基丁酸富集技术研究[J]. 何秋云,杨志伟. 湖北农业科学. 2015(08)
[6]产γ-氨基丁酸乳酸菌及其应用[J]. 李理,刘冶,满朝新,姜毓君. 中国乳品工业. 2014(02)
[7]产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分离鉴定[J]. 韩雪,梁金钟. 食品工业科技. 2012(20)
[8]γ-氨基丁酸及其受体的研究进展[J]. 赵华颖,章劲夫. 中华临床医师杂志(电子版). 2012(14)
[9]Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究[J]. 张天萌,沐万孟,江波,张涛,倪靓霞. 食品与生物技术学报. 2012(03)
[10]γ-氨基丁酸对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠认知功能的影响[J]. 朱学芳,顾永健,陈芬. 中国老年学杂志. 2010(22)
硕士论文
[1]生产GABA乳酸菌的筛选及其相关特性研究[D]. 高晓彤.山东大学 2015
[2]短乳杆菌Lb85谷氨酸脱羧酶的分子改造及其γ-氨基丁酸的生物合成研究[D]. 谢一龙.江南大学 2014
[3]植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的异源表达及条件优化[D]. 莫征杰.浙江大学 2014
[4]产谷氨酸脱羧酶菌株筛选及生产γ-氨基丁酸的研究[D]. 邱文军.江南大学 2014
[5]大豆中γ-氨基丁酸富集及提取的研究[D]. 刘畅.东北农业大学 2013
[6]产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其功能性发酵酸奶的研制[D]. 贤乾隆.广西科技大学 2013
[7]大肠杆菌BL21（DE3）和MG1655的代谢特征比较[D]. 王欣然.山东大学 2012
[8]高效转化生产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌构建及其条件优化[D]. 田灵芝.江南大学 2012
[9]高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选鉴定、条件优化及谷氨酸脱羧酶基因的克隆[D]. 缪存影.浙江师范大学 2010
[10]乳酸菌菌株安全性的研究及优良酸奶发酵剂的筛选[D]. 冯大伟.华东理工大学 2010
本文编号：3336519
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3336519.html
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