利用SmPAL1基因调控丹参中丹酚酸合成
发布时间：2021-09-05 12:18
丹参（Salvia miltiorrhiza）为唇形科鼠尾草属多年生双子叶植物,其干燥根及根茎是我国传统中药材之一,CRISPR/Cas9为一种新型定点基因编辑技术。本研究基于CRISPR/Cas9技术,以酚酸类成分含量较高的山农丹参1号为材料,确定在该技术中应用较多的筛选剂潮霉素的筛选浓度以及适合丹参的除菌抗生素的种类和浓度。采用单因素试验和正交试验设计从超声波预处理时间、乙酰丁香酮浓度、侵染浓度、侵染时间四个因素进行探索,对农杆菌介导的丹参遗传转化体系进行优化,然后以丹参酚酸合成途径中的关键酶基因SmPAL1为目标基因对其进行编辑。对SmPAL1基因的靶位点进行体外靶点效率检测并构建CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的VK005-03表达载体转入丹参受体材料山农丹参1号中,获得了新的转基因植株。主要结果如下:1、通过对丹参愈伤组织诱导优化,潮霉素浓度的筛选,除菌抗生素的筛选以及超声波预处理时间、侵染浓度、乙酰丁香酮浓度、侵染时间四个因素进行单因素试验和正交试验,获得了一套稳定高效的丹参遗传转化体系。2、设计了3个CRISPR/Cas9靶位点（SmPAL...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
丹参无菌苗Fig.1AsepticseedlingofSalviamiltiorrhiza
浓度Concentration/mg·LCallus rate/% 平均值重复ⅠAverage value/%Repeat Ⅰ重复ⅡRepeat Ⅱ重复ⅢRepeat Ⅲ0.01 87.6 87.9 88.2 87.9d0.02 88.7 87.4 88.2 88.1d0.03 92.4 92.6 93.7 92.9c0.04 95.6 96.3 95.2 95.7b0.05 100.0 100.0 100.0 100.0a当培养基中只添加 6-BA 时，丹参出愈率随着 6-BA 浓度的升高呈现先上升后下势，浓度为 3 mg/L 时，出愈率最高，显著高于其他浓度处理，选择 6-BA 浓度为g/L。当培养基中只添加 NAA 时，浓度为 0.2 mg/L 丹参出愈率最高，显著高于其处理，且叶片能够全部分化出绿色愈伤组织（图 2）。当培养基中只添加 2, 4-D 时为 0.05 mg/L 丹参出愈率达到了 100.0%，叶片分化出绿色愈伤组织且质地紧密（根据以上结果选择在MS培养基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg2, 4-D 为诱导愈伤培养基。
浓度为 0.05 mg/L 丹参出愈率达到了 100.0%，叶片分化出绿色愈伤组织且质地紧密（图3）。根据以上结果选择在MS培养基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg/L的 2, 4-D 为诱导愈伤培养基。A B C图 2 含不同激素的培养基中丹参愈伤A: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)Fig. 2 Salvia miltiorrhiza callus in mediums containing different hormonesA: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导转Bt基因海岛棉的获得及抗棉铃虫效果分析[J]. 邓莉,张霞,曲延英,李娟,郭家雁,陈全家. 分子植物育种. 2018(02)
[2]利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型[J]. 刘旭,张平,张晓枫,李兴,白宇,贾克荣,郭晓东,张豪,马晓燕,仓明,刘东军,郭旭东. 遗传. 2018(01)
[3]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得AtLCR67基因敲除突变体[J]. 刘询,庞奥运,刘春林,阮颖. 分子植物育种. 2017(06)
[4]过表达丹参GGPPS研究丹参酮类的生物合成途径[J]. 杨悦,杨长青,王勇,杨蕾. 中国科学:生命科学. 2017(05)
[5]CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建[J]. 周文龙,唐亮,成凯,刘忞之,杨燕,王伟. 生物工程学报. 2017(12)
[6]生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 禹明森,李翔,高马也,杨蕾,倪迪安,王应祥. 植物生理学报. 2017(04)
[7]香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立[J]. 胡春华,邓贵明,孙晓玄,左存武,李春雨,邝瑞彬,杨乔松,易干军. 中国农业科学. 2017(07)
[8]利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2[J]. 邵高能,谢黎虹,焦桂爱,魏祥进,圣忠华,唐绍清,胡培松. 中国水稻科学. 2017(02)
[9]利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,刘侠,万秀清,乔婵,宋琳娜,郭兆奎,李若. 分子植物育种. 2017(02)
[10]不同浓度氮磷配比对丹参生长和活性成分积累的影响[J]. 夏贵惠,王秋玲,王文全,侯俊玲,宋庆燕,罗琳,张豆豆,杨相. 中国中药杂志. 2016(22)
博士论文
[1]丹参基因工程体系创新优化及次生代谢调控应用研究[D]. 刘玉.电子科技大学 2017
硕士论文
[1]土壤条件对不同品系丹参产量和品质的影响[D]. 赵琦.山东农业大学 2016
[2]丹参转录因子基因SmPAP1的转录自激活及其调控丹参次生代谢途径的研究[D]. 李晶.陕西师范大学 2016
[3]若干丹参酚酸的降解和解离性质研究[D]. 黄世超.浙江大学 2016
[4]丹参遗传连锁图谱构建及QTL分析[D]. 宗成堃.山东农业大学 2015
[5]丹参遗传转化体系的构建及SmGGPPS和SmKSL的转基因研究[D]. 成海宁.东北林业大学 2014
[6]红掌花PAL基因的克隆与花色苷含量的研究[D]. 李颖颖.海南大学 2012
[7]转录因子PAP2对丹参酚酸类产物合成的影响[D]. 刘芬.陕西师范大学 2011
[8]丹参酮生物合成相关基因的克隆及其代谢调控[D]. 廖攀.上海师范大学 2010
[9]丹参CPS基因表达载体构建及其对丹参遗传转化的研究[D]. 胥彬.长春中医药大学 2009
[10]丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功能初探[D]. 宋婕.陕西师范大学 2007
本文编号：3385337
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
丹参无菌苗Fig.1AsepticseedlingofSalviamiltiorrhiza
浓度Concentration/mg·LCallus rate/% 平均值重复ⅠAverage value/%Repeat Ⅰ重复ⅡRepeat Ⅱ重复ⅢRepeat Ⅲ0.01 87.6 87.9 88.2 87.9d0.02 88.7 87.4 88.2 88.1d0.03 92.4 92.6 93.7 92.9c0.04 95.6 96.3 95.2 95.7b0.05 100.0 100.0 100.0 100.0a当培养基中只添加 6-BA 时，丹参出愈率随着 6-BA 浓度的升高呈现先上升后下势，浓度为 3 mg/L 时，出愈率最高，显著高于其他浓度处理，选择 6-BA 浓度为g/L。当培养基中只添加 NAA 时，浓度为 0.2 mg/L 丹参出愈率最高，显著高于其处理，且叶片能够全部分化出绿色愈伤组织（图 2）。当培养基中只添加 2, 4-D 时为 0.05 mg/L 丹参出愈率达到了 100.0%，叶片分化出绿色愈伤组织且质地紧密（根据以上结果选择在MS培养基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg2, 4-D 为诱导愈伤培养基。
浓度为 0.05 mg/L 丹参出愈率达到了 100.0%，叶片分化出绿色愈伤组织且质地紧密（图3）。根据以上结果选择在MS培养基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg/L的 2, 4-D 为诱导愈伤培养基。A B C图 2 含不同激素的培养基中丹参愈伤A: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)Fig. 2 Salvia miltiorrhiza callus in mediums containing different hormonesA: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导转Bt基因海岛棉的获得及抗棉铃虫效果分析[J]. 邓莉,张霞,曲延英,李娟,郭家雁,陈全家. 分子植物育种. 2018(02)
[2]利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型[J]. 刘旭,张平,张晓枫,李兴,白宇,贾克荣,郭晓东,张豪,马晓燕,仓明,刘东军,郭旭东. 遗传. 2018(01)
[3]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得AtLCR67基因敲除突变体[J]. 刘询,庞奥运,刘春林,阮颖. 分子植物育种. 2017(06)
[4]过表达丹参GGPPS研究丹参酮类的生物合成途径[J]. 杨悦,杨长青,王勇,杨蕾. 中国科学:生命科学. 2017(05)
[5]CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建[J]. 周文龙,唐亮,成凯,刘忞之,杨燕,王伟. 生物工程学报. 2017(12)
[6]生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 禹明森,李翔,高马也,杨蕾,倪迪安,王应祥. 植物生理学报. 2017(04)
[7]香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立[J]. 胡春华,邓贵明,孙晓玄,左存武,李春雨,邝瑞彬,杨乔松,易干军. 中国农业科学. 2017(07)
[8]利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2[J]. 邵高能,谢黎虹,焦桂爱,魏祥进,圣忠华,唐绍清,胡培松. 中国水稻科学. 2017(02)
[9]利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,刘侠,万秀清,乔婵,宋琳娜,郭兆奎,李若. 分子植物育种. 2017(02)
[10]不同浓度氮磷配比对丹参生长和活性成分积累的影响[J]. 夏贵惠,王秋玲,王文全,侯俊玲,宋庆燕,罗琳,张豆豆,杨相. 中国中药杂志. 2016(22)
博士论文
[1]丹参基因工程体系创新优化及次生代谢调控应用研究[D]. 刘玉.电子科技大学 2017
硕士论文
[1]土壤条件对不同品系丹参产量和品质的影响[D]. 赵琦.山东农业大学 2016
[2]丹参转录因子基因SmPAP1的转录自激活及其调控丹参次生代谢途径的研究[D]. 李晶.陕西师范大学 2016
[3]若干丹参酚酸的降解和解离性质研究[D]. 黄世超.浙江大学 2016
[4]丹参遗传连锁图谱构建及QTL分析[D]. 宗成堃.山东农业大学 2015
[5]丹参遗传转化体系的构建及SmGGPPS和SmKSL的转基因研究[D]. 成海宁.东北林业大学 2014
[6]红掌花PAL基因的克隆与花色苷含量的研究[D]. 李颖颖.海南大学 2012
[7]转录因子PAP2对丹参酚酸类产物合成的影响[D]. 刘芬.陕西师范大学 2011
[8]丹参酮生物合成相关基因的克隆及其代谢调控[D]. 廖攀.上海师范大学 2010
[9]丹参CPS基因表达载体构建及其对丹参遗传转化的研究[D]. 胥彬.长春中医药大学 2009
[10]丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功能初探[D]. 宋婕.陕西师范大学 2007
本文编号：3385337
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3385337.html
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