基于CRISPR/Cas9全基因组基因敲除筛选多能性退出的关键基因
发布时间：2021-09-13 18:09
多能干细胞多能性的退出及功能细胞/组织的获得作为现阶段干细胞与再生医学领域的两个核心问题,是决定干细胞与再生医学研究能否向临床转化的第一道关卡。目前,干细胞多能性的维持方面的研究已经相当成熟,然而对其如何从不断地自我更新和增殖的多能性稳态中退出,乃至分化成特定谱系的特异性细胞或者组织的相关的机理却知之甚少,尽管目前已知的内源性因子Tcf711、Tfe3以及NuRD复合物等在多能性退出中发挥了重要作用,但是其他促进多能干细胞退出多能性基态的基因还有待确定,为此,我们将CRISPR/Cas9全基因组基因敲除这种全新的技术应用于此,首次在基因组层面以一种无偏的方式筛选促进多能性退出的关键基因。本项研究成功建立了基于CRISPR/Cas9全基因组基因敲除筛选多能性退出关键基因模型,利用慢病毒转染/感染技术、lenti-Cas9基因敲除技术、shRNA基因敲降技术,通过PCR重测序、MAGeCK分析（Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout）、GO 分析等数据获取及处理方法,初步发现了 Epc1以及Fbxw7具有促进小鼠胚胎...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４筛选模型简易模式图首先在２ｉ／ｌｉｆ条件下将质粒转入０Ｇ２小鼠胚胎干细胞，抗??性筛选后分化，分化数代，恢复２ｉ／ｌｉｆ培养条件，将存活下来的细胞扩起来，收样作为实验??
?第一章全基因组基因敲除筛选多能性退出关键基因模型的建立???图１－５分化模型三阶段ｍＥＳＣｓ细胞图与（Ｆｉｇ．?１－４）相对应，包括明场及荧光。??Ｆｉｇ?１－５?ｐｈｏｔｏｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｔａｇｅ?ｏｆ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｍｏｄｅｌ．?Ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ??ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｓｔａｇｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ?ｔｏ?（?Ｆｉｇ．?１－４?）?，ｂｏｔｌｉ?ｐｈａｓｅ?ａｎｄ?Ｏｃｔ－ＧＦＰ??３．３?如上所述，向Ｃａｓ９－ＥＳ细胞中转入已经扩增好的ＧｅＣＫＯｖ２．０质粒，分化??两代后，恢复２ｉ／ｌｉｆ终止分化，培养一代后收样提取基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ重??测序，然后使用ＭＡＧｅＣＫ算法多测序结果进行整理；对韵整理出的结果，－??方面，可以用于评价该模型是否已将生效，另一方面，如果模型已经生效，则??进一步对实验组进行分析，获得我们的目的基因。然后通过两轮实验验证，确??定目的基因，再进一步研究其机制。??①?——①①。??ｖ－???Ｃａｓ９－Ｂｌａｓｔ???ＧｅＣＫＯ－Ｌｉｂｒａｒｙ?＾?????ＷＴ?０Ｇ２ＥＳ?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９??－ＧｅＣＫＯ??２?Ｐａｓｓａｇｅｓ?３?Ｐａｓｓａｇｅｓ??▼??ｃ—?＾?２ｉ／Ｌｉｆ?ｃｒ￣?２ｉＡＪｆ?ｆｒｅｅ?＾?＾????Ｉｎｐｕｔ?２??ＭＡＧｅＣＫ?Ｐａｓｓａｇｅｓ?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ??▼??Ｇｅｎｅｓ?Ｒａｎｋｉｎｇ?羞?▲美??－．?！??①①?Ｑ?ｃａｎｄ，ｄａｔｅｓ??Ｇｅｎ
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本文编号：3395098
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４筛选模型简易模式图首先在２ｉ／ｌｉｆ条件下将质粒转入０Ｇ２小鼠胚胎干细胞，抗??性筛选后分化，分化数代，恢复２ｉ／ｌｉｆ培养条件，将存活下来的细胞扩起来，收样作为实验??
?第一章全基因组基因敲除筛选多能性退出关键基因模型的建立???图１－５分化模型三阶段ｍＥＳＣｓ细胞图与（Ｆｉｇ．?１－４）相对应，包括明场及荧光。??Ｆｉｇ?１－５?ｐｈｏｔｏｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｔａｇｅ?ｏｆ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｍｏｄｅｌ．?Ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ??ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｓｔａｇｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ?ｔｏ?（?Ｆｉｇ．?１－４?）?，ｂｏｔｌｉ?ｐｈａｓｅ?ａｎｄ?Ｏｃｔ－ＧＦＰ??３．３?如上所述，向Ｃａｓ９－ＥＳ细胞中转入已经扩增好的ＧｅＣＫＯｖ２．０质粒，分化??两代后，恢复２ｉ／ｌｉｆ终止分化，培养一代后收样提取基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ重??测序，然后使用ＭＡＧｅＣＫ算法多测序结果进行整理；对韵整理出的结果，－??方面，可以用于评价该模型是否已将生效，另一方面，如果模型已经生效，则??进一步对实验组进行分析，获得我们的目的基因。然后通过两轮实验验证，确??定目的基因，再进一步研究其机制。??①?——①①。??ｖ－???Ｃａｓ９－Ｂｌａｓｔ???ＧｅＣＫＯ－Ｌｉｂｒａｒｙ?＾?????ＷＴ?０Ｇ２ＥＳ?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９??－ＧｅＣＫＯ??２?Ｐａｓｓａｇｅｓ?３?Ｐａｓｓａｇｅｓ??▼??ｃ—?＾?２ｉ／Ｌｉｆ?ｃｒ￣?２ｉＡＪｆ?ｆｒｅｅ?＾?＾????Ｉｎｐｕｔ?２??ＭＡＧｅＣＫ?Ｐａｓｓａｇｅｓ?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ??▼??Ｇｅｎｅｓ?Ｒａｎｋｉｎｇ?羞?▲美??－．?！??①①?Ｑ?ｃａｎｄ，ｄａｔｅｓ??Ｇｅｎ
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