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CRISPR/Cas9及ABE基因编辑系统在甘蓝中的应用

发布时间:2021-10-09 17:29
  基因定点编辑技术为植物功能基因研究和作物遗传育种提供了重要的技术支撑。CRISPR/Cas9基因编辑系统作为当前最热门的基因编辑技术,其作用原理主要由sgRNA靶向目的DNA序列并与之结合,从而激活Cas9的核酸酶切割靶DNA,产生靶序列DNA双链断裂(DSB)的损伤。通过非同源末端连接与同源重组的修复方式在靶位点处产生DNA片段的插入或缺失或在靶位点处敲入外源片段或引入点突变,以此来实现对目的基因的突变。另外,在DNA修复机制中,同源重组的效率远远低于非同源末端连接,导致靶位点处修复结果不可控。而单碱基编辑技术在不依赖双链断裂的条件下实现对目标基因片段中特定位点的单个碱基进行转换,可以实现目标基因的精确修饰。目前已开发出实现靶序列中C/G→T/A转换的CBE编辑器和A/T→G/C转换的ABE编辑器,这些单碱基编辑器针对目标基因的修饰可以不再依赖于DNA双链断裂且能产生4种形式的碱基转换,既规避了HR修复途径效率低的限制,也摆脱了NHEJ修复途径的随机性。植物的成花过程受外部环境的影响与错综复杂的内源基因调控。FT、CO调控植物开花进程,突变FT、CO基因使其在植物体内的表达量降低或不... 

【文章来源】:西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】:77 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

CRISPR/Cas9及ABE基因编辑系统在甘蓝中的应用


TALEN作用原理示意图(沈延等,2013)

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西南大学硕士学位论文4图1-2CRISPR/Cas9系统作用原理示意图(Wiedenheftetal.,2012)Figure1-2SchematicdiagramofCRISPR/Cas9systemprinciple(Wiedenheftetal.,2012)1.1.3.2CRISPR/Cas介导的多基因编辑CRISPR/Cas9系统在植物体细胞内工作时每个sgRNA都具有独立性,这使其在同一个体实现多位点或多基因的编辑成为可能。CRISPR/Cas系统主要由sgRNA与Cas9蛋白组成,sgRNA识别并导向Cas9蛋白对靶位点的切割,因此,CRISPR/Cas系统的靶向精确性很大程度上取决于sgRNA生成。研究发现tRNA大量存在于生物体细胞内,能在细胞内迅速加工合成,其合成机制与生物体自身的单个多顺反子基因合成的小片段RNA的机制非常相似(Nakajimaetal.,1981;Kruszkaetal.,2014)。BoxA和BoxB作为tRNA内部启动原件能招募RNA聚合酶PolⅢ型复合体,此外,RNA聚合酶PolⅢ型启动子的表达也能在tRNA序列的作用下加强(Diecietal.,2007;Whiteetal.,2011)。基于以上原理,研究者将tRNA与gRNA进行结合,一种能够同时产生大量gRNA的多顺反子结构tRNA-gRNA的创制得以实现(Xieetal.,2015)。CRISPR/Cas9表达载体中tRNA组分被内源tRNA加工系统识别并将gRNA从tRNA-gRNA转录物中切除出形成单个独立的gRNA,细胞内大量存在的gRNA引导Cas9靶向多个目标位点进行基因组编辑。此外,Ma等应用PCR程序原理使多个表达盒sgRNA能够快速的得到,由Gibson或GoldenGate构建二元表达载体,再与经过优化的Cas9蛋白结合,实

原理图,内源,基因,原理图


第1章文献综述5现了在双子叶和单子叶植物中的多基因编辑,这大大提高了突变效率。图1-3基于内源tRNA表达加工的CRISPR/Cas9多基因编辑原理图(Xieetal.,2015)Figure1-3SchematicdiagramofCRISPR/Cas9multigeneeditingbasedonendogenoustRNAexpressionprocessing(Xieetal.,2015)1.1.3.3CRISPR/Cas9技术在作物中的应用自然进化过程中基因突变是生物多样性的重要来源,在作物育种中基因突变也为优良品种的选育提供了更多的选择。尽管物理诱变(如γ射线)和化学诱变(如亚硝基乙基脲NEH和甲基磺酸乙酯EMS)的方法能引入植物基因的突变,但此种方法引入的基因突变具有随机性而且难以实现目标性状的定向突变,在作物育种方面难以广泛应用。CRISPR/Cas9系统能实现目的基因的精准打靶完成定向突变,此系统至开发以来即被育种家们广泛应用于作物育种,迅速成为了作物遗传育种中的热门技术。在水稻中Gn1a、DEP1、GS3、IPA1分别控制水稻穗粒数、直立密穗、单粒重和分蘖数,Li等利用CRISPR/Cas9技术对这上述基因进行突变,成功创制了优良性状的水稻品种,大幅度的提高了产量(Lietal.,2016)。此外,利用此系统进行水稻抗病基因与抗除草剂基因的编辑,获得了抗稻瘟病和抗除草剂的水稻品种(Liuetal.,2012;Sunetal.,2016)。在玉米育种中,育种家一直探索着降低玉米中的肌醇六磷酸(PA),因为这类物质对于单胃动物来说难以吸收消化。ZmIPK1A、ZmIPK、ZmMRP基因控制着PA合成途径,Liang等应用CRISPR/Cas9技术成功敲除ZmIPK基因,大幅度降低了玉米中的PA含量(Liangetal.,2014)。另外,CRISPR/Cas9技术也被用于玉米代谢途径调控(Fengetal.,2016)、盐胁迫(Xingetal.,2014)和干旱胁迫(Habbenetal.,2014;Shietal.,2016)等基因编辑。


本文编号:3426751

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