籽粒苋优质贮藏蛋白基因AhAMA1功能分析与蛋白核小球藻的遗传转化
发布时间：2021-10-11 08:30
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一种新资源食品,蛋白含量高,氨基酸种类齐全。然而,必需氨基酸中含硫氨基酸（甲硫氨酸+半胱氨酸）含量较低。因此,提高含硫氨基酸含量有助于改善蛋白核小球藻蛋白品质和开发蛋白及必需氨基酸营养均衡的优质微藻食品。籽粒苋（Amaranthus hypochondriacus L.）是一年生粮、饲、菜兼用型作物,种子蛋白质含量高、营养丰富。源于籽粒苋成熟种子的AMA1蛋白营养均衡,富含8种人体必需氨基酸,且未现人体过敏反应,是一种优质贮藏蛋白。本文从籽粒苋发育种子分离编码优质贮藏蛋白的AhAMA1基因,检测其时空表达谱。应用生物信息学工具系统分析AhAMA1蛋白理化特性及系统进化。构建AhAMA1基因植物组成型表达载体,通过基因枪法对蛋白核小球藻进行遗传转化,以期筛选培育蛋白质和必需氨基酸含量高且均衡的蛋白核小球藻优质株系。此外,采用农杆菌（Agrobacterium）介导渗透侵染法在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶组织瞬时表达AhAMA1,检测其对烟叶组织蛋白质、油脂、淀粉含量等生理生化性状的影响,以评估AhAM...
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
籽粒苋幼苗、种子、RNA和AhAMA1表达Figure2.1A.hypochondriacusseedling,developingseedsandAhAMA1expressionA：盆栽籽粒苋幼苗（A:SeedlingofA.hypochondriacusgrowninpot）
-12-2.3.2AhAMA1基因ORF克隆以籽粒苋（cv.SX-04）发育种子RNA反转录获得的cDNA为模板，用分别带有XbaI和SmaI酶切位点的目的基因引物进行高保真PCR，扩增AhAMA1基因ORF。扩增的靶基因片段（AhAMA1，915bp）与GFP（720bp）基因连接后经XbaI和SmaI双酶切后电泳检测结果如图2.2所示，PCR扩增的条带与预期目的基因条带（1635bp）相符。PCR扩增产物序列测序结果与AhAMA1基因开放阅读框序列完全一致。2.3.3AhAMA1基因植物组成型表达载体的构建对XbaI和SmaI双酶切后的AhAMA1-GFP和pBI121表达载体进行连接获得重组质粒。再用重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性菌落。提取质粒，用XbaI和SmaI进行双酶切鉴定（图2.2）以及DNA测序。如图2.2所示，AhAMA1基因ORF-GFP正确的亚克隆到pBI121载体的多克隆位点，获得了AhAMA1基因植物组成型表达载体AhAMA1-GFP-pBI121（图2.3，表达载体简示图，示意RB-LB）。图2.2酶切鉴定重组质粒AhAMA1-GFP-pBI121Figure2.2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidAhAMA1-GFP-pBI121注：M1、M2：DANmarker；1：pBI121载体；2：AhAMA1-GFP；3：AhAMA1-GFP-pBI121重组质粒；4：XbaI和SmaI双酶切的重组质粒AhAMA1-GFP-pBI121。Note:M1、M2:DANmarker;1:pBI121vector;2:AhAMA1-GFP;3:AhAMA1-GFP-pBI121recombinantplasmid;4:XbaIandSmaIdouble-digestedrecombinantplasmidAhAMA1-GFP-pBI121图2.3AhAMA1-GFP-pBI121植物组成型表达载体简示图Figure2.3SchematicdiagramofplantconstitutiveexpressionvectorAhAMA1-GFP-pBI121
-16-图2.5农杆菌侵染烟草叶组织、AhAMA1基因表达和蛋白、油脂及淀粉含量检测Figure2.5Agrobacteriuminfection,AhAMA1geneexpression,andcontentsofprotein,oilandstarchinN.benthamianaleaftissues.A：农杆菌侵染后烟草叶片；B：烟叶中NbActin和AhAMA1基因相对表达量；C：烟叶中AhAMA1基因表达RT-PCR检测；D：烟叶蛋白、油脂和淀粉含量测定。A:N.benthamianaleafinfectedbyAgrobacterium;B:RelativeexpressionofNbActinandAhAMA1genesinthetobaccoleaves;C:DetectionofAhAMA1geneexpressionintobaccoleavesbyRT-PCR;D:Determinationofprotein,oilandstarchcontentsinthetabaccoleaves.M：Marker；1：GV3101-AMA1-GFP-pBI121侵染后烟叶；2：GV3101-pBI121侵染烟叶；3：野生型烟叶。M:Marker;1:GV3101-AMA1-GFP-pBI121infestedtobaccoleaf;2:GV3101-pBI121infestedtobaccoleaf;3:Wild-typetobaccoleaf.
【参考文献】：
期刊论文
[1]温度对小球藻和铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光特性的影响[J]. 马欠,邓春暖,郭锋锋. 中州大学学报. 2018(04)
[2]pH对淡水小球藻叶绿素荧光参数及生长的影响[J]. 薄香兰,刘兴,柴英辉,窦勇,高金伟,贾旭颖,周文礼. 天津农学院学报. 2018(01)
[3]LC-MS/MS法同时测定烟草中的16种游离氨基酸和6种Amadori化合物[J]. 张婕,葛永辉,杨慧,朱文静,向章敏,耿召良. 烟草科技. 2017(11)
[4]氮胁迫对埃氏小球藻生长及油脂积累的影响[J]. 程蔚兰,邵雪梅,宋程飞,史飞飞,季春丽,李润植. 生物技术通报. 2017(11)
[5]微藻基因工程概述[J]. 闫晋飞,杨玉莹,马淑霞. 生物学通报. 2017(04)
[6]抗生素在微藻工程中的应用研究进展[J]. 刘莹莹,张文蕾,侯和胜,佟少明. 生命科学. 2016(09)
[7]温度和光照对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响[J]. 臧正蓉,解修俊,赵佩佩,郇丽,黄爱优,张宝玉,潘光华,王广策. 海洋科学. 2015(07)
[8]利用微藻提取类胡萝卜素方法研究进展[J]. 许颖颖,王晚晴,华威,刘文慧,田朝玉,程艳玲. 食品工业科技. 2016(03)
[9]4株沙漠小球藻对几种常用抗生素的敏感性研究[J]. 朱军保,王丹,汪文伦,许万云,高剑峰. 生物技术通讯. 2014(06)
[10]不同碳氮源对一株产油小球藻油脂积累的影响[J]. 金虹,P.K.Andy Hong,Diana Bao,吕海棠,李文林,马明英. 安徽师范大学学报(自然科学版). 2014(04)
博士论文
[1]微藻仿生硅矿化及其应用[D]. 熊威.浙江大学 2016
[2]有机营养对蛋白核小球藻生化特性的影响[D]. 张维国.南京大学 2014
硕士论文
[1]外源SAD基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响[D]. 杨青峰.广东海洋大学 2017
[2]微藻的破壁和干燥技术研究[D]. 程贺.北京化工大学 2017
[3]绿肥籽粒苋生长与还田过程中的氮钾循环特征研究[D]. 吴凯.中国农业科学院 2017
[4]LED光照对富锌和富硒螺旋藻生长的影响[D]. 高海洋.广东海洋大学 2016
[5]氮源对紫球藻生理的影响及紫球藻蛋白酶的初步研究[D]. 沙沙.山东大学 2012
[6]高赖氨酸基因CFLR、籽粒苋平衡蛋白基因AmA1遗传转化水稻的研究[D]. 彭雪娟.福建农林大学 2012
[7]环境因素对黄河藻类生长影响的研究[D]. 郭艳琴.内蒙古科技大学 2010
[8]蛋白核小球藻培养方式的比较及其叶黄素的提取检测[D]. 桂林.华中农业大学 2001
本文编号：3430161
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
籽粒苋幼苗、种子、RNA和AhAMA1表达Figure2.1A.hypochondriacusseedling,developingseedsandAhAMA1expressionA：盆栽籽粒苋幼苗（A:SeedlingofA.hypochondriacusgrowninpot）
-12-2.3.2AhAMA1基因ORF克隆以籽粒苋（cv.SX-04）发育种子RNA反转录获得的cDNA为模板，用分别带有XbaI和SmaI酶切位点的目的基因引物进行高保真PCR，扩增AhAMA1基因ORF。扩增的靶基因片段（AhAMA1，915bp）与GFP（720bp）基因连接后经XbaI和SmaI双酶切后电泳检测结果如图2.2所示，PCR扩增的条带与预期目的基因条带（1635bp）相符。PCR扩增产物序列测序结果与AhAMA1基因开放阅读框序列完全一致。2.3.3AhAMA1基因植物组成型表达载体的构建对XbaI和SmaI双酶切后的AhAMA1-GFP和pBI121表达载体进行连接获得重组质粒。再用重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性菌落。提取质粒，用XbaI和SmaI进行双酶切鉴定（图2.2）以及DNA测序。如图2.2所示，AhAMA1基因ORF-GFP正确的亚克隆到pBI121载体的多克隆位点，获得了AhAMA1基因植物组成型表达载体AhAMA1-GFP-pBI121（图2.3，表达载体简示图，示意RB-LB）。图2.2酶切鉴定重组质粒AhAMA1-GFP-pBI121Figure2.2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidAhAMA1-GFP-pBI121注：M1、M2：DANmarker；1：pBI121载体；2：AhAMA1-GFP；3：AhAMA1-GFP-pBI121重组质粒；4：XbaI和SmaI双酶切的重组质粒AhAMA1-GFP-pBI121。Note:M1、M2:DANmarker;1:pBI121vector;2:AhAMA1-GFP;3:AhAMA1-GFP-pBI121recombinantplasmid;4:XbaIandSmaIdouble-digestedrecombinantplasmidAhAMA1-GFP-pBI121图2.3AhAMA1-GFP-pBI121植物组成型表达载体简示图Figure2.3SchematicdiagramofplantconstitutiveexpressionvectorAhAMA1-GFP-pBI121
-16-图2.5农杆菌侵染烟草叶组织、AhAMA1基因表达和蛋白、油脂及淀粉含量检测Figure2.5Agrobacteriuminfection,AhAMA1geneexpression,andcontentsofprotein,oilandstarchinN.benthamianaleaftissues.A：农杆菌侵染后烟草叶片；B：烟叶中NbActin和AhAMA1基因相对表达量；C：烟叶中AhAMA1基因表达RT-PCR检测；D：烟叶蛋白、油脂和淀粉含量测定。A:N.benthamianaleafinfectedbyAgrobacterium;B:RelativeexpressionofNbActinandAhAMA1genesinthetobaccoleaves;C:DetectionofAhAMA1geneexpressionintobaccoleavesbyRT-PCR;D:Determinationofprotein,oilandstarchcontentsinthetabaccoleaves.M：Marker；1：GV3101-AMA1-GFP-pBI121侵染后烟叶；2：GV3101-pBI121侵染烟叶；3：野生型烟叶。M:Marker;1:GV3101-AMA1-GFP-pBI121infestedtobaccoleaf;2:GV3101-pBI121infestedtobaccoleaf;3:Wild-typetobaccoleaf.
【参考文献】：
期刊论文
[1]温度对小球藻和铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光特性的影响[J]. 马欠,邓春暖,郭锋锋. 中州大学学报. 2018(04)
[2]pH对淡水小球藻叶绿素荧光参数及生长的影响[J]. 薄香兰,刘兴,柴英辉,窦勇,高金伟,贾旭颖,周文礼. 天津农学院学报. 2018(01)
[3]LC-MS/MS法同时测定烟草中的16种游离氨基酸和6种Amadori化合物[J]. 张婕,葛永辉,杨慧,朱文静,向章敏,耿召良. 烟草科技. 2017(11)
[4]氮胁迫对埃氏小球藻生长及油脂积累的影响[J]. 程蔚兰,邵雪梅,宋程飞,史飞飞,季春丽,李润植. 生物技术通报. 2017(11)
[5]微藻基因工程概述[J]. 闫晋飞,杨玉莹,马淑霞. 生物学通报. 2017(04)
[6]抗生素在微藻工程中的应用研究进展[J]. 刘莹莹,张文蕾,侯和胜,佟少明. 生命科学. 2016(09)
[7]温度和光照对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响[J]. 臧正蓉,解修俊,赵佩佩,郇丽,黄爱优,张宝玉,潘光华,王广策. 海洋科学. 2015(07)
[8]利用微藻提取类胡萝卜素方法研究进展[J]. 许颖颖,王晚晴,华威,刘文慧,田朝玉,程艳玲. 食品工业科技. 2016(03)
[9]4株沙漠小球藻对几种常用抗生素的敏感性研究[J]. 朱军保,王丹,汪文伦,许万云,高剑峰. 生物技术通讯. 2014(06)
[10]不同碳氮源对一株产油小球藻油脂积累的影响[J]. 金虹,P.K.Andy Hong,Diana Bao,吕海棠,李文林,马明英. 安徽师范大学学报(自然科学版). 2014(04)
博士论文
[1]微藻仿生硅矿化及其应用[D]. 熊威.浙江大学 2016
[2]有机营养对蛋白核小球藻生化特性的影响[D]. 张维国.南京大学 2014
硕士论文
[1]外源SAD基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响[D]. 杨青峰.广东海洋大学 2017
[2]微藻的破壁和干燥技术研究[D]. 程贺.北京化工大学 2017
[3]绿肥籽粒苋生长与还田过程中的氮钾循环特征研究[D]. 吴凯.中国农业科学院 2017
[4]LED光照对富锌和富硒螺旋藻生长的影响[D]. 高海洋.广东海洋大学 2016
[5]氮源对紫球藻生理的影响及紫球藻蛋白酶的初步研究[D]. 沙沙.山东大学 2012
[6]高赖氨酸基因CFLR、籽粒苋平衡蛋白基因AmA1遗传转化水稻的研究[D]. 彭雪娟.福建农林大学 2012
[7]环境因素对黄河藻类生长影响的研究[D]. 郭艳琴.内蒙古科技大学 2010
[8]蛋白核小球藻培养方式的比较及其叶黄素的提取检测[D]. 桂林.华中农业大学 2001
本文编号：3430161
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3430161.html
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