利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向改良水稻稻瘟病抗性
发布时间：2021-10-12 14:00
水稻作为世界上食用人口最多的农作物,其产量每年都会因稻瘟病的流行而减产。目前,控制稻瘟病爆发的有效策略就是使用抗性品种。近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术的诞生解决了传统育种过程中育种年限及连锁累赘等问题,为作物遗传改良提供了新的育种平台。本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻Pita,Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗抗稻瘟病水稻材料。本研究主要结果如下:1.Pi21基因是在隐性状态下发挥对稻瘟病菌的抗性,而ERF922则负调控稻瘟病菌的抗性,Pita对稻瘟病的抗感差异是由于第918位氨基酸位点的变化而引起。我们选择3个基因的第一外显子靠近ATG附近的序列作为靶序列构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014。在T0代转基因阳性株中,Pita,Pi21和ERF922三个基因发生突变的频率分别为75%,85%和75%,Pita发生突变的基因型多为双等位突变（47.1...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1植物PTI和ETI过程中的普遍作用机制（Tsudaetal.,2012）
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言锌指蛋白能够特异性的识别 DNA 序列上的三个连续的碱基，通常是将 3-6 个锌指蛋白串联起来去特异识别 DNA 序列上的 9-18 个相邻的碱基；FokI 是一种来源于海床黄杆菌的 IIS 型限制性内切酶，仅在形成二聚体结构的条件下，才能实现其切割功能。两者通过人工组装形成锌指核酸酶，在将质粒转化受体细胞前，先在体外通过噬菌体展示等技术筛选具有与靶序列特异性切割活性的锌指，随后再导入受体生物中，特异性的切割靶基因从而促使细胞进行同源重组和非同源末端连接修复，产生不同类型的定点突变（图 1.3.1）。基于此，ZFN 技术很快便应用到斑马鱼、植物细胞及基因治疗的研究上（Doyon et al., 2008；Wright et al.,2005；Urnov etal.,2005）。
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言酸数为 63 时，其两翼的碱基数则为 14-23 bp，然而，Miller 等（2011）研究表明，两个 TALE结构域间的碱基距离为 14-19 bp 时有最大的剪切效率。相较于 ZFN 技术，类转录激活因子核酸酶在 DNA 序列特异性识别上更具灵活性，构造过程简便，剪切效率大大提高，广泛应用于不同物种的基因编辑，包括斑马鱼（Yang et al.,2017）、拟南芥（Christian et al., 2013）、水稻（Shanet al.,2015）等基因组的定点编辑。Yang 等（2017）以斑马鱼的 Foxl2 基因为靶标获得两种能稳定遗传的不同突变类型的斑马鱼纯合系；Christian 等（2013）利用 TALEN 系统对拟南芥的五个基因：ADH1、TT4、MAPKKK1、DSK2B 和 NATA2 进行编辑，转基因株系体细胞突变频率高达 41-73%；Shan 等（2015）通过 TALEN 技术编辑水稻的香味基因 OsBADH2 来改良水稻香味品质。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J]. 杨海河,毕冬玲,张玉,邹小维,高晓庆,袁正杰,曲海艳,何海燕,瞿绍洪. 分子植物育种. 2017(11)
[2]利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析[J]. 王芳权,范方军,李文奇,朱金燕,王军,仲维功,杨杰. 中国水稻科学. 2016(05)
[3]分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系[J]. 倪大虎,易成新,李莉,汪秀峰,张毅,赵开军,王春连,章琦,王文相,杨剑波. 作物学报. 2008(01)
[4]利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 陈红旗,陈宗祥,倪深,左示敏,潘学彪,朱旭东. 中国水稻科学. 2008(01)
[5]水稻基因组中抗病基因正选择方式及基因转换的研究[J]. 季军,杨四海,田大成. 中国农业科学. 2007(09)
博士论文
[1]稻瘟病菌定向选择的分子证据和抗稻瘟病近等基因累加系的分子选育[D]. 何月秋.中国农业大学 1999
本文编号：3432716
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1植物PTI和ETI过程中的普遍作用机制（Tsudaetal.,2012）
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言锌指蛋白能够特异性的识别 DNA 序列上的三个连续的碱基，通常是将 3-6 个锌指蛋白串联起来去特异识别 DNA 序列上的 9-18 个相邻的碱基；FokI 是一种来源于海床黄杆菌的 IIS 型限制性内切酶，仅在形成二聚体结构的条件下，才能实现其切割功能。两者通过人工组装形成锌指核酸酶，在将质粒转化受体细胞前，先在体外通过噬菌体展示等技术筛选具有与靶序列特异性切割活性的锌指，随后再导入受体生物中，特异性的切割靶基因从而促使细胞进行同源重组和非同源末端连接修复，产生不同类型的定点突变（图 1.3.1）。基于此，ZFN 技术很快便应用到斑马鱼、植物细胞及基因治疗的研究上（Doyon et al., 2008；Wright et al.,2005；Urnov etal.,2005）。
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言酸数为 63 时，其两翼的碱基数则为 14-23 bp，然而，Miller 等（2011）研究表明，两个 TALE结构域间的碱基距离为 14-19 bp 时有最大的剪切效率。相较于 ZFN 技术，类转录激活因子核酸酶在 DNA 序列特异性识别上更具灵活性，构造过程简便，剪切效率大大提高，广泛应用于不同物种的基因编辑，包括斑马鱼（Yang et al.,2017）、拟南芥（Christian et al., 2013）、水稻（Shanet al.,2015）等基因组的定点编辑。Yang 等（2017）以斑马鱼的 Foxl2 基因为靶标获得两种能稳定遗传的不同突变类型的斑马鱼纯合系；Christian 等（2013）利用 TALEN 系统对拟南芥的五个基因：ADH1、TT4、MAPKKK1、DSK2B 和 NATA2 进行编辑，转基因株系体细胞突变频率高达 41-73%；Shan 等（2015）通过 TALEN 技术编辑水稻的香味基因 OsBADH2 来改良水稻香味品质。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J]. 杨海河,毕冬玲,张玉,邹小维,高晓庆,袁正杰,曲海艳,何海燕,瞿绍洪. 分子植物育种. 2017(11)
[2]利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析[J]. 王芳权,范方军,李文奇,朱金燕,王军,仲维功,杨杰. 中国水稻科学. 2016(05)
[3]分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系[J]. 倪大虎,易成新,李莉,汪秀峰,张毅,赵开军,王春连,章琦,王文相,杨剑波. 作物学报. 2008(01)
[4]利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 陈红旗,陈宗祥,倪深,左示敏,潘学彪,朱旭东. 中国水稻科学. 2008(01)
[5]水稻基因组中抗病基因正选择方式及基因转换的研究[J]. 季军,杨四海,田大成. 中国农业科学. 2007(09)
博士论文
[1]稻瘟病菌定向选择的分子证据和抗稻瘟病近等基因累加系的分子选育[D]. 何月秋.中国农业大学 1999
本文编号：3432716
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3432716.html
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