马蓝色氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

发布时间：2021-10-13 23:13

　　目的克隆马蓝Baphicacanthus cusia吲哚类生物碱合成途径的色氨酸合成酶（tryptophan synthase,TSB）基因,命名为BcTSB（GenBank登录号AYM45644.1）,对其生物信息学和表达进行分析。方法基于前期马蓝转录组数据库,获得BcTSB基因开放阅读框（ORF）,运用生物信息学手段对基因功能做出初步预测,构建pET32a-BcTSB原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马蓝不同组织（根、茎、叶）中TSB表达水平。结果克隆的BcTSB基因ORF长度为1452bp,编码483个氨基酸,生物信息学预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体,该蛋白相对分子质量为51 665.89,pET-32a载体包含18 000的标签。SDS-PAGE分析在70 000处出现目的蛋白条带,与理论预期值大小一致。qRT-PCR分析显示BcTSB基因在马蓝不同组织中均有表达,且在茎中的表达量最高。结论通过对BcTSB基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因功能及调控奠定了实验基础。 

【文章来源】：中草药. 2020,51(24)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

马蓝RNA凝胶电泳(A)和Bc TSB基因(B) PCR扩增

通过NCBI在线Blastp对蛋白进行同源序列搜索，选取独脚金（GER52969.1）等16种不同物种的TSB氨基酸序列，采用DNAMAN软件对氨基酸进行氨基酸序列进行多重序列比对（图5），发现Bc TSB蛋白与其他蛋白保守区域相似性最高达到88%，表明Bc TSB蛋白的保守性较高。利用MEGA 6.0软件的NJ法，构建不同生物TSB的进化树，结果发现Bc TSB基因与药用植物独脚金（GER52969.1）、红鼠尾草（TEY67686.1）亲缘关系较近，可聚为一支（图6）。图3 马蓝Bc TSB蛋白亲疏水性、结构域、跨膜区及信号肽预测

马蓝Bc TSB蛋白亲疏水性、结构域、跨膜区及信号肽预测

【参考文献】：
期刊论文
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[3]马蓝等79种植物分支酸合成酶的生物信息学分析[J]. 于剑,叶齐,宁书菊,李卿,谭何新,冯静娴,陈瑞兵,马晓莉,公培民,赵璇璇,张磊,魏道智.  中国中药杂志. 2018(04)
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硕士论文
[1]马蓝吲哚类生物碱合成关键基因ASA和ASB的克隆与功能研究[D]. 张青磊.华侨大学 2017
[2]不同外源物质处理对马蓝生理特性以及有效成分含量的影响[D]. 可晓旭.福建农林大学 2017



本文编号：3435587