体外慢病毒介导HO-1基因转染对人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用及机制研究

发布时间：2021-10-18 21:44

　　目的1.构建慢病毒载体（Lentivirus vector,LV）介导的血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）重组过表达病毒（LV-HO-1）并利用其转染ARPE-19细胞;2.探讨LV-HO-1对RPE细胞凋亡的保护作用;3.探讨LV-HO-1对RPE细胞凋亡保护作用的机制。方法1.构建HO-1过表达的重组慢病毒载体;2.建立RPE凋亡模型:选择24h作为单一凋亡时间,正常RPE细胞H₂O₂半抑制浓度（IC50=209umol H₂O₂）作为最适凋亡浓度,建立RPE凋亡模型。3.按不同处理因素将RPE细胞分为四组:空白对照组:正常培养RPE细胞;单纯损伤组:正常RPE细胞经H₂O₂诱导凋亡;空载体-RPE组:慢病毒介导空载体转染RPE细胞;HO-1-RPE组:慢病毒介导HO-1基因转染RPE细胞;4.应用细胞计数法绘制各组RPE细胞生长曲线;5.荧光显微镜观察各组RPE细胞荧光信号表达情况;CCK-8（Cell Counting ... 

【文章来源】：福建医科大学福建省

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

1LV-HO-1测序结果

13图3.1.2LV-HO-1测序结果比对3.2ARPE-19细胞经光镜鉴定第三代ARPE-19细胞株，细胞传代起第五天，细胞呈单层贴壁成长，细胞体积小，形态呈长形，多角形及椭圆形，细胞形态饱满，胞内含丰富的黑色颗粒，胞浆呈半透明状，细胞排列并不紧密，间有缝隙存在（如图3.2.1）。错误!未指定书签。图3.2.1.P3视网膜色素上皮细胞株（×100）Fig3.2.1.P3day5retinalpigmentepithelium（×100）3.3HO-1重组慢病毒滴度测定及荧光显微镜鉴定慢病毒Lv-RNA-HO-1病毒滴度的测定结果：将病毒MOI值（感染复数）梯度分别设置为3、6、9，经病毒感染后待293T细胞的融合率达到90%，观察到MOI值为9的分组荧光较强但细胞状态较差；MOI值为3的分组荧光强度太弱，MOI值为6的分组细胞状态较好，选择MOI值为6的分组进行后续实验（图3.3.1-3.3.4），荧光百分比在10~30%之间，计算滴度为0.033μl，满足下一步实验需要。（滴度（tu/ml）=细胞数*荧光百分比*MOI(1)*病毒稀释倍数*10^3）

13图3.1.2LV-HO-1测序结果比对3.2ARPE-19细胞经光镜鉴定第三代ARPE-19细胞株，细胞传代起第五天，细胞呈单层贴壁成长，细胞体积小，形态呈长形，多角形及椭圆形，细胞形态饱满，胞内含丰富的黑色颗粒，胞浆呈半透明状，细胞排列并不紧密，间有缝隙存在（如图3.2.1）。错误!未指定书签。图3.2.1.P3视网膜色素上皮细胞株（×100）Fig3.2.1.P3day5retinalpigmentepithelium（×100）3.3HO-1重组慢病毒滴度测定及荧光显微镜鉴定慢病毒Lv-RNA-HO-1病毒滴度的测定结果：将病毒MOI值（感染复数）梯度分别设置为3、6、9，经病毒感染后待293T细胞的融合率达到90%，观察到MOI值为9的分组荧光较强但细胞状态较差；MOI值为3的分组荧光强度太弱，MOI值为6的分组细胞状态较好，选择MOI值为6的分组进行后续实验（图3.3.1-3.3.4），荧光百分比在10~30%之间，计算滴度为0.033μl，满足下一步实验需要。（滴度（tu/ml）=细胞数*荧光百分比*MOI(1)*病毒稀释倍数*10^3）

【参考文献】：
期刊论文
[1]Rosmarinic acid elicits neuroprotection in ischemic stroke via Nrf2 and heme oxygenase 1 signaling[J]. Hai-Ying Cui,Xiang-Jian Zhang,Yi Yang,Cong Zhang,Chun-Hua Zhu,Jiang-Yong Miao,Rong Chen.  Neural Regeneration Research. 2018(12)
[2]胆红素对急性肺损伤大鼠肺血管内皮细胞核因子κB,细胞间粘附分子1表达的影响[J]. 李建强,高晓玲,刘卓拉,徐永健,张珍祥.  中国组织化学与细胞化学杂志. 2004(01)



本文编号：3443548