黑曲霉中veA及laeA基因功能的研究

发布时间：2021-10-29 01:44

　　黑曲霉作为一种重要的工业发酵微生物,广泛应用于食品及酶制剂等生产领域,但是其产生的真菌毒素一直威胁着人类的健康。本文拟研究黑曲霉全局调控因子veA及laeA对赭曲霉毒素A（OTA）的生物合成、菌体的生长发育和氧化胁迫下应激反应的调控作用,这将为有效控制黑曲霉的生长与产毒及进一步探究黑曲霉中网络调控提供理论参考依据。（1）本实验通过农杆菌侵染的方法成功筛选出△veA及AlaeA菌株,通过基因组重测序的方法测定AveA及AlaeA菌株中潮霉素基因插入位置,证实潮霉素基因插入位置正确,插入方式为反向插入,基因拷贝数为1。经稳定性验证,AveA及AlaeA菌株具有良好的遗传稳定性。（2）通过与黑曲霉A14表型特征对比,发现AveA及AlaeA菌株的产孢及菌落生长直径均有不同程度的减少,菌丝长且松散,枝节相对较少,而分生孢子形态无明显差异。（3）通过研究OTA的生物合成量,发现AveA菌株在生长7d过程中均未能检测到OTA,通过qRT-PCR分析OTA合成关键基因pks的表达情况,结果表明pks的表达与黑曲霉A14相比急剧减少;△laeA菌株的OTA合成量与野生菌株相比极大减少,在生长第7 d,... 

【文章来源】：天津科技大学天津市

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２寄生曲霉中ＲＯＳ调控机制［６９］??Ｆｉｇ?１－２．?Ｐｒｏｐｏｓｅｄ?ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｏｔａｌ?ＲＯＳ?ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ?ｉｎ?Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ?ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ．??

２８７５?ｂｐ，为了能够让测序所得碱基序列更加准确，在设计ｖｄ－ｆ／ｖｅＸ－ｒ时有目的的向两??端延伸，使得两引物理论扩增长度为３２０１?ｂｐ；?ｖｅＪ－ｆ／ｖｄ－ｒ扩增黑曲霉Ａ１４中ｖｅＪ基??因ＰＣＲ电泳图如下图３－１?（ａ）所示，扩增结果与理论值大小相近。通过切胶回收的方??法对扩增获得的基因片段进行回收，并连接到ＰＧＭ１８－Ｔ载体上，ＰＣＲ验证条带??位置正确后，如下图３－１?（ｂ）所示，送至华大测序。??Ｍ?１?２?３?Ｍｌ??５ｋｂ—??３ｋｂ—??５ｋｂ—??３ｋｂ—??Ｉｋｂ—Ｈ??Ｖｓ?１??（ａ）?（ｂ）??图３－ｌｖｅｖ４基因的扩增（ａ）及回收（ｂ）。??Ｆｉｇ．３－１?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?（ａ）?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ｐＧＭ１８－Ｔ－ｖ＾?（ｂ）．??注（ａ）?Ｍ：?５ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ，?１－３：?ｖｄ?基因?ＰＣＲ产物；Ｃｂ）?Ｍ：?５ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ，?１：以?ｐＧＭ１８－??丁－ｖｄ为模板扩增ｖｄ基因??３．１．２黑曲霉Ａ１４ｗＷ基因的测序及比对结果??对ｖｄ基因进行测序，将ｖｄ两端设计的多余的部分去掉后，将序列结果与ＮＣＢＩ??上黑曲霉ＣＢＳ５１３．８８己经公布的ｖｄ基因进行比对，相似性达到１００％，这说明成功??扩增出黑曲霉Ａ１４ｖｅｊ基因，比对结果见附录１所示。??３６??

出了?ｖｄ的同源左右臂，比对结果见附录２－１及２－２所示。??３．１．５黑曲霉Ａ１４?ｖｄ基因敲除质粒的构建及验证??敲除质粒ｐ４４－Ｖｅ』构建示意图如下图３－３所示。按照２．２．４的实验操作，在质粒??ｐ４４的基础上构建ｐ４４－ｖｅＪ敲除质粒，首先通过及ｏＲ?Ｉ／Ｘｐｎ?Ｉ分别酶切ｐ４４及ｖｅｄ－Ｈｌ，??将酶切后的ｖｄ－Ｈｌ片段通过Ｔ４连接酶连接到酶切后的ｐ４４长片段上，从而通过转化??筛选出连接成功的ｐ４４－ｖｄ－Ｈｌ；?ｖｄ－Ｈ２利用５漏Ｈｌ／ｉ／ｚＷＩＩＩ同质粒ｐ４４－ｖｄ－Ｈｌ同时??３７??

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3463723