野生角瓜根结线虫抗性相关基因CmWRKY20的克隆与表达分析
发布时间：2021-10-31 14:41
WRKY转录因子参与调控与植物免疫反应相关的转录重编程,对植物抗病性发挥调控作用。为了解析WRKY在野生角瓜对根结线虫（RKN）抗性中的作用,通过RT-PCR并结合RACE技术从角瓜根系中克隆CmWRKY20全长cDNA序列,采用DNAStar和DNAMAN进行氨基酸序列与系统进化分析,通过qRT-PCR进行基因表达分析,利用农杆菌介导的烟草叶片细胞转化法进行编码蛋白的亚细胞定位。结果表明,CmWRKY20转录因子cDNA序列全长1 603 bp,5′非翻译区646 bp,3′非翻译区320 bp,ORF长度1 017 bp,编码338个氨基酸,GenBank登录号MN365875;CmWRKY20具有1个核定位信号和1个WRKY保守结构域,锌指基序为C2H2,归类于WRKY第Ⅱ组,与黄瓜、甜瓜等作物WRKY的氨基酸序列同源性较高,亲缘关系较近;CmWRKY20表达表现为抗病材料高于感病材料,根、茎高于叶片,CmWRKY20受根结线虫快速诱导,水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）对CmWRKY20表达既有协同效应又有拮抗作用,CmWRKY2...
【文章来源】：华北农学报. 2020,35(04)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CmWRKY20基因全长克隆
利用InterProScan对CmWRKY20编码的蛋白进行结构域分析,结果表明,CmWRKY20具有WRKY家族的结构特征:第414-446位氨基酸为锌指结构域,锌指基序为C2H2型,第394-400位氨基酸为WRKY结构域(WRKYGQK),根据Eulgem等[13]的分类原则将CmWRKY20归类于第Ⅱ组。经PSORT预测,CmWRKY20在第365-370位氨基酸有核定位信号KKRKHR。从NCBI非冗余蛋白数据库(Nr)中下载了与CmWRKY20蛋白同源的7条蛋白序列,其物种名称、序列登录号及其氨基酸序列相似性分别为:黄瓜(Cucumis sativus,XP_004154104.1,94.25%)、甜瓜(Cucumis melo,XP_008449343.1,93.29%)、黄瓜(Cucumis sativus,XP_011649180.1,91.38%)、苦瓜(Momordica charantia,XP_022146052.1,76.40%)、中国南瓜(Cucurbita moschata,XP_022963451.1,73.75%)、印度南瓜(Cucurbita maxima,XP_022967410.1,73.16%)、瓠瓜(Cucurbita pepo subsp. pepo,XP_023554095.1,73.16%),通过DNAMAN 将CmWRKY20与7条蛋白序列进行比对,氨基酸序列的同一性为83.97%,表明上述蛋白具有极高的序列相似性(图2)。利用DNAMAN 8.0构建系统进化树,结果显示,野生角瓜CmWRKY20与黄瓜(XP_004154104.1)、黄瓜(XP_011649180.1)、甜瓜(XP_008449343.1)亲缘关系较近,说明它们同属(黄瓜属)不同种的关系,而与葫芦科其他属的作物如苦瓜(XP_022146052.1)、瓠瓜(XP_023554095.1)、印度南瓜(XP_022967410.1)、中国南瓜(XP_022963451.1)亲缘关系相对较远(图3)。
提取角瓜不同组织中的总RNA,以角瓜Ef1α基因作内参进行qRT-PCR分析。结果表明,CmWRKY20表达表现为抗病材料CmR07高于感病材料CmS12,根、茎高于叶片(图4-A);根结线虫侵染后,CmR07中CmWRKY20的表达先降低后升高,在接种后14 d开始升高并于接种后28 d出现大幅增加,CmWRKY20在28 d的相对表达量显著高于其他接种时间点(P<0.05),而CmS12中CmWRKY20的表达则表现为在接种根结线虫后逐渐降低并于接种后21 d出现小幅增加但在28 d又回落(图4-B);无论抗病材料还是感病材料,当SA处理浓度低于1.0 mmol/L时,CmWRKY20表达随着SA处理浓度的增加而逐渐增强,但当SA处理浓度超过1.0 mmol/L时迅速降低(图4-C),而施用MeJA则使CmWRKY20表达逐渐降低,当MeJA处理浓度超过0.1 mmol/L时,CmWRKY20表达降低(图4-D);无论CmR07还是CmS12,根系喷施SA与MeJA后,PAL、AOS基因的表达随SA、MeJA处理浓度的增大而先逐渐增强,但当SA和MeJA处理浓度超过0.5 mmol/L时,PAL、AOS基因的表达逐渐降低(图4-E、F)。图4 CmWRKY20及其相关基因在接种线虫和激素处理后的qRT-PCR表达
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物与线虫互作的信号传导及调控机制研究进展[J]. 叶德友,漆永红,李敏权. 草业学报. 2016(10)
[2]不同温度下刺角瓜过氧化物酶基因的表达及其对抗南方根结线虫作用的影响[J]. 魏偲,史倩倩,马玉琴,马金慧,茆振川,凌键,杨宇红,谢丙炎. 园艺学报. 2016(08)
[3]刺角瓜对南方根结线虫的抗性及特征分析[J]. 马金慧,茆振川,李惠霞,谢丙炎. 园艺学报. 2014(01)
[4]抗南方根结线虫黄瓜—酸黄瓜渐渗系的筛选及鉴定[J]. 叶德友,钱春桃,陈劲枫. 园艺学报. 2011(12)
硕士论文
[1]黄瓜/酸黄瓜渐渗系抗南方根结线虫病相关抗性机制及QTLs定位研究[D]. 刘雪娇.南京农业大学 2014
[2]黄瓜根结线虫取食位点早期形成相关WRKY基因的分离与分析[D]. 张雅涵.中国农业科学院 2011
本文编号：3468319
【文章来源】：华北农学报. 2020,35(04)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CmWRKY20基因全长克隆
利用InterProScan对CmWRKY20编码的蛋白进行结构域分析,结果表明,CmWRKY20具有WRKY家族的结构特征:第414-446位氨基酸为锌指结构域,锌指基序为C2H2型,第394-400位氨基酸为WRKY结构域(WRKYGQK),根据Eulgem等[13]的分类原则将CmWRKY20归类于第Ⅱ组。经PSORT预测,CmWRKY20在第365-370位氨基酸有核定位信号KKRKHR。从NCBI非冗余蛋白数据库(Nr)中下载了与CmWRKY20蛋白同源的7条蛋白序列,其物种名称、序列登录号及其氨基酸序列相似性分别为:黄瓜(Cucumis sativus,XP_004154104.1,94.25%)、甜瓜(Cucumis melo,XP_008449343.1,93.29%)、黄瓜(Cucumis sativus,XP_011649180.1,91.38%)、苦瓜(Momordica charantia,XP_022146052.1,76.40%)、中国南瓜(Cucurbita moschata,XP_022963451.1,73.75%)、印度南瓜(Cucurbita maxima,XP_022967410.1,73.16%)、瓠瓜(Cucurbita pepo subsp. pepo,XP_023554095.1,73.16%),通过DNAMAN 将CmWRKY20与7条蛋白序列进行比对,氨基酸序列的同一性为83.97%,表明上述蛋白具有极高的序列相似性(图2)。利用DNAMAN 8.0构建系统进化树,结果显示,野生角瓜CmWRKY20与黄瓜(XP_004154104.1)、黄瓜(XP_011649180.1)、甜瓜(XP_008449343.1)亲缘关系较近,说明它们同属(黄瓜属)不同种的关系,而与葫芦科其他属的作物如苦瓜(XP_022146052.1)、瓠瓜(XP_023554095.1)、印度南瓜(XP_022967410.1)、中国南瓜(XP_022963451.1)亲缘关系相对较远(图3)。
提取角瓜不同组织中的总RNA,以角瓜Ef1α基因作内参进行qRT-PCR分析。结果表明,CmWRKY20表达表现为抗病材料CmR07高于感病材料CmS12,根、茎高于叶片(图4-A);根结线虫侵染后,CmR07中CmWRKY20的表达先降低后升高,在接种后14 d开始升高并于接种后28 d出现大幅增加,CmWRKY20在28 d的相对表达量显著高于其他接种时间点(P<0.05),而CmS12中CmWRKY20的表达则表现为在接种根结线虫后逐渐降低并于接种后21 d出现小幅增加但在28 d又回落(图4-B);无论抗病材料还是感病材料,当SA处理浓度低于1.0 mmol/L时,CmWRKY20表达随着SA处理浓度的增加而逐渐增强,但当SA处理浓度超过1.0 mmol/L时迅速降低(图4-C),而施用MeJA则使CmWRKY20表达逐渐降低,当MeJA处理浓度超过0.1 mmol/L时,CmWRKY20表达降低(图4-D);无论CmR07还是CmS12,根系喷施SA与MeJA后,PAL、AOS基因的表达随SA、MeJA处理浓度的增大而先逐渐增强,但当SA和MeJA处理浓度超过0.5 mmol/L时,PAL、AOS基因的表达逐渐降低(图4-E、F)。图4 CmWRKY20及其相关基因在接种线虫和激素处理后的qRT-PCR表达
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物与线虫互作的信号传导及调控机制研究进展[J]. 叶德友,漆永红,李敏权. 草业学报. 2016(10)
[2]不同温度下刺角瓜过氧化物酶基因的表达及其对抗南方根结线虫作用的影响[J]. 魏偲,史倩倩,马玉琴,马金慧,茆振川,凌键,杨宇红,谢丙炎. 园艺学报. 2016(08)
[3]刺角瓜对南方根结线虫的抗性及特征分析[J]. 马金慧,茆振川,李惠霞,谢丙炎. 园艺学报. 2014(01)
[4]抗南方根结线虫黄瓜—酸黄瓜渐渗系的筛选及鉴定[J]. 叶德友,钱春桃,陈劲枫. 园艺学报. 2011(12)
硕士论文
[1]黄瓜/酸黄瓜渐渗系抗南方根结线虫病相关抗性机制及QTLs定位研究[D]. 刘雪娇.南京农业大学 2014
[2]黄瓜根结线虫取食位点早期形成相关WRKY基因的分离与分析[D]. 张雅涵.中国农业科学院 2011
本文编号：3468319
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