CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型
发布时间：2021-11-06 11:11
基因编辑是指借助细胞自身的基因组损伤修复机制对目标基因的核苷酸序列进行碱基删除、插入、定点突变和组合编辑等基因操作技术。近年出现的CRISPR/Cas9定点基因编辑技术极大提高了基因编辑效率、推进了基因功能的研究,并在构建人类疾病模型、推动基因治疗、加快农作物和动物的遗传改良等领域有着巨大的应用潜力。在传统的呼吸道干细胞功能研究中,需要使用基因型相同的细胞群作为研究对象。如何运用CRISPR技术对呼吸道干细胞群进行基因编辑,并高效的筛选阳性编辑的细胞成为了一个急需攻克的难题。本研究首次将荧光报告基因的优势与CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术的特点相结合,建立了有效的基因编辑细胞富集平台,突破了 CRISPR技术在干细胞研究领域的应用瓶颈。首先,采用经体外酶切筛选出高效靶向Loxp位点的sgRNA（LoxP-sgRNA）转染表达Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP（ROSA-TG）报告基因小鼠气道上皮细胞,结果发现CRISPR/Cas9高效介导LoxP位点中间的tdTomato基因剪切,红色荧光细胞向绿色和无色荧光的转变率达到72.7%。...
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
正常成年小鼠体内稳态时肺上皮的组成lavtFig.l}lThecompositionoftheadultmouselungepitheliumduringnormalhomeostasists1
的两个同样序列的Ｌｏｘｐ位点．将使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，导致原来表达红色膜蛋白??的红色细胞将因为的切除改为表达￡ＧＦＰ绿色膜蛋白而逐渐变成绿色。由此，该??模型以细胞表面明显的红绿荧光转变，报告其内部基因被编辑的事件．如图２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??图２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位点设计示意图??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ转基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ设计??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ质粒设计并验证靶向敲除如〇的引导ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列与两段重复的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在设计敲??除的ｓｇＲＮＡ时．采用了两种不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ设计在膜定位序列，Ｃａｓ９单酶切靶??向位点形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因为移码突变而无法表达。２）?ｓｇＲＮＡ设汁在??重复的序列，Ｃａｓ９将在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ内识别两个耙向位点形成双酶切，使两个耙位点内碱基??敲除，两个靶位点同时发生片段插入或缺失使得其后的序列因为移码突变而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位点设Ｕ？草图如图２－２所示，根据ｓｇＲＮＡ设计原则以及单酶切和双??酶切两种策略．分别设计１条单酶切和２条双酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
的两个同样序列的Ｌｏｘｐ位点．将使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，导致原来表达红色膜蛋白??的红色细胞将因为的切除改为表达￡ＧＦＰ绿色膜蛋白而逐渐变成绿色。由此，该??模型以细胞表面明显的红绿荧光转变，报告其内部基因被编辑的事件．如图２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??图２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位点设计示意图??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ转基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ设计??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ质粒设计并验证靶向敲除如〇的引导ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列与两段重复的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在设计敲??除的ｓｇＲＮＡ时．采用了两种不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ设计在膜定位序列，Ｃａｓ９单酶切靶??向位点形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因为移码突变而无法表达。２）?ｓｇＲＮＡ设汁在??重复的序列，Ｃａｓ９将在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ内识别两个耙向位点形成双酶切，使两个耙位点内碱基??敲除，两个靶位点同时发生片段插入或缺失使得其后的序列因为移码突变而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位点设Ｕ？草图如图２－２所示，根据ｓｇＲＮＡ设计原则以及单酶切和双??酶切两种策略．分别设计１条单酶切和２条双酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
本文编号：3479728
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
正常成年小鼠体内稳态时肺上皮的组成lavtFig.l}lThecompositionoftheadultmouselungepitheliumduringnormalhomeostasists1
的两个同样序列的Ｌｏｘｐ位点．将使／ＪＴｂｗａｒｏ－ｓｆｏ／？兀件切除，导致原来表达红色膜蛋白??的红色细胞将因为的切除改为表达￡ＧＦＰ绿色膜蛋白而逐渐变成绿色。由此，该??模型以细胞表面明显的红绿荧光转变，报告其内部基因被编辑的事件．如图２－１。??ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ??Ｖ——＇??Ｉ?ｒ．Ａｆｉ?ＥＧＦｐｊｐＡ??ＬｏｘＰ?ＬｏｘＰ??图２－１?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ＩＢ位点设计示意图??Ｆｉｇ．２－１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＬｏｘＰ－ｓｇＲＮＡ?ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｄｅｓｉｇｎ??２．３．１．２?ＲＯＳＡ－ＴＧ转基因中靶向，ｃ／７ｂ／ｗ＂ｏ序歹ｌｊ的ｓｇＲＮＡ设计??利用己有的ＲＯＳＡ－ＴＧ质粒设计并验证靶向敲除如〇的引导ｓｇＲＮＡ。由于所用的膜定??位基因的序列是由一段膜定位序列与两段重复的；Ｔｏｗａ／ｏ序列融合而成。所以在设计敲??除的ｓｇＲＮＡ时．采用了两种不同策略：１）?ｓｇＲＮＡ设计在膜定位序列，Ｃａｓ９单酶切靶??向位点形成片段插入或缺失使得其后的７ｂｗ加〇序列因为移码突变而无法表达。２）?ｓｇＲＮＡ设汁在??重复的序列，Ｃａｓ９将在／ｔ／７Ｖ；ｗａｔｏ内识别两个耙向位点形成双酶切，使两个耙位点内碱基??敲除，两个靶位点同时发生片段插入或缺失使得其后的序列因为移码突变而被敲除。??ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｓｇＲＮＡ的靶向位点设Ｕ？草图如图２－２所示，根据ｓｇＲＮＡ设计原则以及单酶切和双??酶切两种策略．分别设计１条单酶切和２条双酶切靶向敲除的ｓｇＲＮＡ．命名及序列如??下
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