基于CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠

发布时间：2021-11-07 00:33

　　CRISPR/Cas9是广泛存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统,能够剪切外源基因,抵御病毒对细菌的入侵,最早由nakata等发现于1987年,直到2010年CRISPR的机制和功能才被研究清楚。在2013年,CRISPR/Cas9被整合为基因编辑工具,其中CRISPR/Cas9三个必要元素（Cas9内切酶,crRNA和tracrRNA）可被融合为两个,通过将crRNA和tracrRNA合成为一个单链引导RNA,从而扩大了其在基因组编辑上的运用。因为该技术有着操作简单、编辑效率高等优势得到了非常广泛的应用,也大大降低了基因编辑的门槛,所以我们选择依托这项技术来研究靶基因自身的功能和该基因在某些疾病里的作用。本课题由两个部分构成,技术上都运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术。第一部分是通过实验室前期工作,发现KDM2A基因在哮喘模型中存在着表达量降低的现象,但是对该基因自身的功能和作用并不十分清楚。所以在本文中利用CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系来研究该基因的功能,并取得了如下研究结果:1.对KDM2A基因转录本分析和比较,选择KDM2A-212进行设计,成功得到... 

【文章来源】：中南民族大学湖北省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

1CRISPR/Cas9技术工作原理

第三章 实验方法3.1 KDM2A 基因靶位点设计与载体构建3.1.1 sgRNA 设计（1）目的基因片段选取与设计在 ensembl 数据库中找出靶基因的外显子区段，并将靠近起始位点的外子先行进行 sgRNA 设计。将选择后的外显子片段在麻省理工学院的 CRISDesign 软件（http://CRISPR.mit.edu/）中进行 sgRNA 设计。根据得分高低顺序此选择 5 条 sgRNA 进行后续实验。（2）打靶载体利用pX458载体进行sgRNA的完整构建。根据载体结构序列gRNAscaff碱基序列和酶切位点粘性末端合成完整引物。

4.1 敲除载体构建将得到的重组 KDM2A-pX458 载体进行验证，利用通用引物 U6 测序。经过测序验证后，如图(4.1.1)黑框处表示插入的位置，经过比较后发现，经正确插入载体构建位点。图 4.1.1 设计引物插入位点验证黑框空白处代表插入载体的在整个质粒环中的位置插入位点的位置进行比对分析正确后，需要确认继续比对该引物片段的碱和插入位点前后是否发生碱基图片，由于 CRISPR/Cas9 技术的工作原理依靠基配对识别，对于测序出现突变的载体不能继续使用。如图(4.1.2)所示，经过对后，设计的引物在插入载体后为发生任何突变。


本文编号：3480817