白桦BpbHLH7和BpbHLH8基因的克
发布时间：2021-11-11 22:06
白桦外皮中含有丰富的三萜类产物,具有多种药理活性,其中白桦脂酸、白桦脂醇类代谢产物拥有抗肿瘤、抗艾滋病的功效。自然情况下,白桦外皮中三萜含量低,而体外合成成本高,因此,利用基因工程技术探索三萜合成与生产的方法尤为重要。转录因子以其“多点调控”的方式可以从整体角度对代谢途径进行调控,进而提高植物中目标代谢产物的含量。本实验以白桦（BetulaPlatyphllasuk.）为实验材料,结合实验室前期筛选的响应MeJA和SA信号的bHLH转录因子基因,拟克隆与白桦三萜合成相关的BpbHLH7和BpbHLH8基因全长及其启动子序列,并进行生物信息学分析;研究了BpbHLH7和BpbHLH8基因时空及非生物胁迫表达模式;同时分别构建了BpbHLH7和BpbHLH8的酵母表达载体及BpbHLH8的植物过表达和干扰载体,对其在白桦和酵母中的表达特性和基因功能进行研究。以期明确BpbHLH7和BpbHLH8转录因子在白桦生长发育及三萜合成调控中的功能,为白桦三萜类物质代谢工程研究提供理论依据和技术支持。本研究结果如下:1.以白桦组培苗RNA反转录的cDNA为模板,应用特异性引物结合RT-PCR技术,克...
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－３白桦三萜化合物合成途径中的关键酶［６３］??以基因工程手段，向植物内引入次生代谢关键酶基因，可以提高植物中目的产物含??量的积累
形成的二聚体与下游目的基因启动子区域中Ｅ－ｂｏｘ结合，从而调控该基因的转录??［８５］。与动物相比，植物的ｂＨＬＨ转录因子的研究相对来说比较滞后，只有少数植物??ｂＨＬＨ转录因子的功能得到解析。目前为止，分别从拟南芥和水稻中分离鉴定得到了??１５８和１７３个ｂＨＬＨ转录因子［８６１，Ｌｉ根据系统发生、内含子／外显子结构及蛋白构型将??水稻和拟南芥的所有ｂＨＬＨ转录因子分成了?２５个家族，又根据ｂＨＬＨ结构域Ｎ端的序??列特征将水稻和拟南芥的ｂＨＬＨ转录因子分成了?４个小组（图１－５）?［８７］。这些ｂＨＬＨ转??录因子在植物对外界环境的反应和自身生长发育中起到了重要作用［８＇在干旱条件下，??ｂＨＬＨ转录因子Ｊ／ＭＦＣ２对受ＡＢＡ诱导表达的基因起激活作用［８９］；在拟南芥中，当??０６／／ＺＪ／２过表达，植株的渗透胁迫抗性及耐盐性均得到提高［９（）１；?Ｃｈｉｍｍｕｓａｍｙ１９１１在拟南??芥中鉴定了一个能够编码ｂＨＬＨ转录因子的基因／ＣＥ／，并发现当／Ｃ￡／基因的过表达，??植物的抗冷性明显提升；Ｋｏｎｄｏｕ１９２１的研究结果表明，ｂＨＬＨ家族转录因子的缺失??突变体中，植物体胚胎发育迟缓。同时，ｂＨＬＨ转录因子在信号转导及生物合成中发挥??重要作用，如ｂＨＬＨ家族的不同成员分别参与了青花素［９３１、黄酮［９４］、色氨酸１９５１、赤霉??素［９６］等的生物合成，也能够参与调控水稻的ｆｆｘ基因的表达［９７１、拟南芥中的三色分化??［９８］、植物中的光敏色素［９９１和油菜类固醇［＿信号转导。??
根据白桦转录组数据库中ｂＨＬＨ７基因已知序列的两端设计特异引物，以白桦总??ＲＮＡ的反转录产物为模板，用办Ｗ／Ｚ／／７－Ｆ／Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增。通过１％琼脂糖凝??胶电泳检测到一条约７５０?ｂｐ的特异扩增条带，如图２－１。测序结果显示，ＰＣＲ产物长度??为７４２?ｂｐ，暂命名为ＢｐｂＨＬＨ７。??２＿—??图２－１?■册基因全长ＰＣＲ电泳检测??（注：Ｍ为２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１？２为５ｐＷ／Ｚ／／７基因扩增产物，３￣４为基因扩增产物）??２．２．１．２仰服／／７全长序列生物信息学分析??（１）办Ｗ／Ｉ／／７基因分子特征分析??以白桦组培苗ＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得转录因子办Ｗ／ＺＪ／７??基因ｃＤＮＡ为７４２?ｂｐ，应用ＮＣＢＩ的ＯＲＦ?ｆｍｄｅｒ功能对该全长基因的开放阅读框??（ｏｐｅｎｉｎｇ?ｒｅａｄｉｎｇ?ｆｒａｍｅ，?ＯＲＦ）进行预测，结果显不其为完整的ＯＲＦ，长为６１８?ｂｐ，编??码２０５个氨基酸（图２－２）。利用ＢＬＡＳＴｐ对此ｃＤＮＡ全长序列进行序列比对，发现该??氨基酸序列与碧桃（户／％服ｓ＇ｐｍ＇／ｃｏ）未知蛋白（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＸＰ＿００７１９８８６４）相似度为??６４％。??应用ＢＬＡＳＴ中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎｓ功能对该基因产物氨基酸序列保守区域进行预??测，结果如图２－３，显示该蛋白质在５？５０?ａａ有螺旋－环－螺旋的ＤＮＡ
【参考文献】：
期刊论文
[1]bHLH转录因子在茉莉酸信号诱导植物次生产物合成中的作用及分子机制[J]. 李欣,李影,曲子越,孙璐,王思瑶,詹亚光,尹静. 植物生理学报. 2017(01)
[2]bHLH转录因子调控药用植物萜类化合物生物合成的研究进展[J]. 张凯伦,罗祖良,郭玉华,石宏武,马小军. 中国现代中药. 2017(01)
[3]在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究[J]. 梁童瑶,邢丙聪,张治海,麻鹏达,梁宗锁,韩蕊莲. 西北林学院学报. 2017(01)
[4]药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展[J]. 许燕,赵爽,邸亮. 安徽医药. 2016(03)
[5]调控药用植物药效成分合成的转录因子研究进展[J]. 高珂,王玲,吴素瑞,隋春. 中草药. 2015(20)
[6]工程化酿酒酵母合成植物三萜类化合物[J]. 朱明,王彩霞,李春. 化工学报. 2015(09)
[7]遗传改造酿酒酵母生产植物萜类药物的策略[J]. 黄晓斌,仲蕾蕾. 微生物学通报. 2015(10)
[8]Ca2+在介导MeJA诱导白桦悬浮培养三萜合成中的作用[J]. 马泓思,潘亚婕,王艳,尹静,詹亚光,赵微,张梦岩,梁甜. 植物研究. 2015(01)
[9]刺五加鲨烯环氧酶基因家族2成员表达特性的分析[J]. 龙月红,李非非,杨果,邢朝斌. 中国中药杂志. 2015(01)
[10]2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定[J]. 马艺沔,袁丽钗,张林甦,侯学敏,卢善发. 中草药. 2014(09)
博士论文
[1]代谢工程改造酿酒酵母生物合成类胡萝卜素的研究[D]. 谢文平.浙江大学 2015
[2]调控紫杉醇合成转录因子TcMYC和TcWRKY1的克隆及功能研究[D]. 李书涛.华中科技大学 2012
硕士论文
[1]白桦鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因的克隆及表达特性研究[D]. 张梦岩.东北林业大学 2016
[2]钙离子在SA和MeJA诱导白桦三萜合成中的作用及机制[D]. 王艳.东北林业大学 2014
[3]干扰人参CS基因的表达对人参三萜成分含量的影响[D]. 何沐阳.吉林大学 2013
[4]温度和水分对银杏叶黄酮合成的影响[D]. 郭旭琴.南京林业大学 2012
[5]诱导子组合对白桦三萜合成调控及MeJA抑制性消减文库分析[D]. 任春林.东北林业大学 2012
[6]MeJA和SA对白桦幼树三萜合成调控及FPS基因克隆[D]. 李春晓.东北林业大学 2012
[7]三七三萜皂甙合成途径鲨烯环氧酶基因的克隆及初步表达[D]. 李珅.广西医科大学 2006
本文编号：3489616
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－３白桦三萜化合物合成途径中的关键酶［６３］??以基因工程手段，向植物内引入次生代谢关键酶基因，可以提高植物中目的产物含??量的积累
形成的二聚体与下游目的基因启动子区域中Ｅ－ｂｏｘ结合，从而调控该基因的转录??［８５］。与动物相比，植物的ｂＨＬＨ转录因子的研究相对来说比较滞后，只有少数植物??ｂＨＬＨ转录因子的功能得到解析。目前为止，分别从拟南芥和水稻中分离鉴定得到了??１５８和１７３个ｂＨＬＨ转录因子［８６１，Ｌｉ根据系统发生、内含子／外显子结构及蛋白构型将??水稻和拟南芥的所有ｂＨＬＨ转录因子分成了?２５个家族，又根据ｂＨＬＨ结构域Ｎ端的序??列特征将水稻和拟南芥的ｂＨＬＨ转录因子分成了?４个小组（图１－５）?［８７］。这些ｂＨＬＨ转??录因子在植物对外界环境的反应和自身生长发育中起到了重要作用［８＇在干旱条件下，??ｂＨＬＨ转录因子Ｊ／ＭＦＣ２对受ＡＢＡ诱导表达的基因起激活作用［８９］；在拟南芥中，当??０６／／ＺＪ／２过表达，植株的渗透胁迫抗性及耐盐性均得到提高［９（）１；?Ｃｈｉｍｍｕｓａｍｙ１９１１在拟南??芥中鉴定了一个能够编码ｂＨＬＨ转录因子的基因／ＣＥ／，并发现当／Ｃ￡／基因的过表达，??植物的抗冷性明显提升；Ｋｏｎｄｏｕ１９２１的研究结果表明，ｂＨＬＨ家族转录因子的缺失??突变体中，植物体胚胎发育迟缓。同时，ｂＨＬＨ转录因子在信号转导及生物合成中发挥??重要作用，如ｂＨＬＨ家族的不同成员分别参与了青花素［９３１、黄酮［９４］、色氨酸１９５１、赤霉??素［９６］等的生物合成，也能够参与调控水稻的ｆｆｘ基因的表达［９７１、拟南芥中的三色分化??［９８］、植物中的光敏色素［９９１和油菜类固醇［＿信号转导。??
根据白桦转录组数据库中ｂＨＬＨ７基因已知序列的两端设计特异引物，以白桦总??ＲＮＡ的反转录产物为模板，用办Ｗ／Ｚ／／７－Ｆ／Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增。通过１％琼脂糖凝??胶电泳检测到一条约７５０?ｂｐ的特异扩增条带，如图２－１。测序结果显示，ＰＣＲ产物长度??为７４２?ｂｐ，暂命名为ＢｐｂＨＬＨ７。??２＿—??图２－１?■册基因全长ＰＣＲ电泳检测??（注：Ｍ为２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１？２为５ｐＷ／Ｚ／／７基因扩增产物，３￣４为基因扩增产物）??２．２．１．２仰服／／７全长序列生物信息学分析??（１）办Ｗ／Ｉ／／７基因分子特征分析??以白桦组培苗ＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得转录因子办Ｗ／ＺＪ／７??基因ｃＤＮＡ为７４２?ｂｐ，应用ＮＣＢＩ的ＯＲＦ?ｆｍｄｅｒ功能对该全长基因的开放阅读框??（ｏｐｅｎｉｎｇ?ｒｅａｄｉｎｇ?ｆｒａｍｅ，?ＯＲＦ）进行预测，结果显不其为完整的ＯＲＦ，长为６１８?ｂｐ，编??码２０５个氨基酸（图２－２）。利用ＢＬＡＳＴｐ对此ｃＤＮＡ全长序列进行序列比对，发现该??氨基酸序列与碧桃（户／％服ｓ＇ｐｍ＇／ｃｏ）未知蛋白（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＸＰ＿００７１９８８６４）相似度为??６４％。??应用ＢＬＡＳＴ中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎｓ功能对该基因产物氨基酸序列保守区域进行预??测，结果如图２－３，显示该蛋白质在５？５０?ａａ有螺旋－环－螺旋的ＤＮＡ
【参考文献】：
期刊论文
[1]bHLH转录因子在茉莉酸信号诱导植物次生产物合成中的作用及分子机制[J]. 李欣,李影,曲子越,孙璐,王思瑶,詹亚光,尹静. 植物生理学报. 2017(01)
[2]bHLH转录因子调控药用植物萜类化合物生物合成的研究进展[J]. 张凯伦,罗祖良,郭玉华,石宏武,马小军. 中国现代中药. 2017(01)
[3]在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究[J]. 梁童瑶,邢丙聪,张治海,麻鹏达,梁宗锁,韩蕊莲. 西北林学院学报. 2017(01)
[4]药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展[J]. 许燕,赵爽,邸亮. 安徽医药. 2016(03)
[5]调控药用植物药效成分合成的转录因子研究进展[J]. 高珂,王玲,吴素瑞,隋春. 中草药. 2015(20)
[6]工程化酿酒酵母合成植物三萜类化合物[J]. 朱明,王彩霞,李春. 化工学报. 2015(09)
[7]遗传改造酿酒酵母生产植物萜类药物的策略[J]. 黄晓斌,仲蕾蕾. 微生物学通报. 2015(10)
[8]Ca2+在介导MeJA诱导白桦悬浮培养三萜合成中的作用[J]. 马泓思,潘亚婕,王艳,尹静,詹亚光,赵微,张梦岩,梁甜. 植物研究. 2015(01)
[9]刺五加鲨烯环氧酶基因家族2成员表达特性的分析[J]. 龙月红,李非非,杨果,邢朝斌. 中国中药杂志. 2015(01)
[10]2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定[J]. 马艺沔,袁丽钗,张林甦,侯学敏,卢善发. 中草药. 2014(09)
博士论文
[1]代谢工程改造酿酒酵母生物合成类胡萝卜素的研究[D]. 谢文平.浙江大学 2015
[2]调控紫杉醇合成转录因子TcMYC和TcWRKY1的克隆及功能研究[D]. 李书涛.华中科技大学 2012
硕士论文
[1]白桦鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因的克隆及表达特性研究[D]. 张梦岩.东北林业大学 2016
[2]钙离子在SA和MeJA诱导白桦三萜合成中的作用及机制[D]. 王艳.东北林业大学 2014
[3]干扰人参CS基因的表达对人参三萜成分含量的影响[D]. 何沐阳.吉林大学 2013
[4]温度和水分对银杏叶黄酮合成的影响[D]. 郭旭琴.南京林业大学 2012
[5]诱导子组合对白桦三萜合成调控及MeJA抑制性消减文库分析[D]. 任春林.东北林业大学 2012
[6]MeJA和SA对白桦幼树三萜合成调控及FPS基因克隆[D]. 李春晓.东北林业大学 2012
[7]三七三萜皂甙合成途径鲨烯环氧酶基因的克隆及初步表达[D]. 李珅.广西医科大学 2006
本文编号：3489616
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