中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建
发布时间：2021-11-20 11:01
CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶（Cellulose synthase,CESA）为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶（Cellulose synthase,CESA）gRNA（guide RNA）的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5’端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载...
【文章来源】：分子植物育种. 2017,15(06)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
重组质粒及其PCR检测电泳分析
(hairpin)的部分碱基序列重叠。表1所用引物序列Table1Theprimersequences引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')TCAAGCGAACCAGTAGGCTTGAAACGAGTTCGTAATGATTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAATCATTACGAACTCGTTTCACATGCACCTAATTTCACTAGATGTGTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG引物名称PrimernamegRNA-FgRNA-RUbi3p218(F)ISceIR(R)中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建ExpressionVectorConstructionofCelluloseSynthasegRNAWithCRISPR/Cas9GeneKnockoutSystemofL.chinense图2p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体结构Figure2p201N-Cas9-CESA1-gRNAcarrierstructure2197
Cas系统来进行基因组的定点编辑(Lietal.,2013;Nekrasovetal.,2013)。但CRISPR/Cas系统在鹅掌楸基因编辑中的应用暂时还未见报道。本研究利用克隆获得中国鹅掌楸(Liriodendronchinense)纤维素合酶1(CESA1)基因序列，设计CESA1-gRNA,建立一步法获得表达gRNA的p201N-Cas9载体，作为后期鹅掌楸纤维素合酶基因编辑研究的载体工具。1结果与分析1.1PCR检测本试验选取对1号单克隆菌液提取的重组质粒进行PCR扩增，用2组引物均可以扩增得到相应大小的片段，与预期的条带大小一致，证实其为阳性重组子(图1)。1.2测序基因编辑的效率与gRNA序列有关。将阳性菌液送样测序，重复测序3次，证实插入的gRNA序列图1重组质粒及其PCR检测电泳分析注:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1和2代表p201N-Cas9-CESA1-gRNA质粒;3和4分别代表引物1和引物2Figure1RecombinantplasmidanditsPCRdetectionelec-trophoresisanalysisNote:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1and2representedp201N-Cas9-CESA1-gRNAplasmid;3and4representedprimer1andprimer22196
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用[J]. 蒲强,罗嘉,沈林園,李强,张谊,张顺华,朱砺. 中国生物工程杂志. 2015(11)
[2]CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J]. 康峰,卢胜明,张海峰. 实验动物科学. 2014(04)
[3]CRISPR-Cas介导的基因编辑工具[J]. 左其生,李东,张亚妮,李碧春. 生物技术通报. 2014(07)
[4]基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J]. 王梦瑶,杨亦农,边红武. 中国生物化学与分子生物学报. 2014(05)
[5]CRISPR-Cas基因组改造技术研究进展[J]. 颜雯,李海涛,向华,王晓虎. 广东农业科学. 2014(02)
[6]一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J]. 刘思也,夏海滨. 中国生物工程杂志. 2013(10)
[7]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[8]CRISPR结构与功能研究进展[J]. 杨超杰,邱少富,宋宏彬. 军事医学. 2013(02)
[9]成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR的研究进展[J]. 王丽丽,何进,王阶平. 微生物学报. 2011(08)
[10]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
硕士论文
[1]鹅掌楸纸浆林种源选择与生长过程研究[D]. 骆羿.中南林业科技大学 2007
本文编号：3507183
【文章来源】：分子植物育种. 2017,15(06)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
重组质粒及其PCR检测电泳分析
(hairpin)的部分碱基序列重叠。表1所用引物序列Table1Theprimersequences引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')TCAAGCGAACCAGTAGGCTTGAAACGAGTTCGTAATGATTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAATCATTACGAACTCGTTTCACATGCACCTAATTTCACTAGATGTGTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG引物名称PrimernamegRNA-FgRNA-RUbi3p218(F)ISceIR(R)中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建ExpressionVectorConstructionofCelluloseSynthasegRNAWithCRISPR/Cas9GeneKnockoutSystemofL.chinense图2p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体结构Figure2p201N-Cas9-CESA1-gRNAcarrierstructure2197
Cas系统来进行基因组的定点编辑(Lietal.,2013;Nekrasovetal.,2013)。但CRISPR/Cas系统在鹅掌楸基因编辑中的应用暂时还未见报道。本研究利用克隆获得中国鹅掌楸(Liriodendronchinense)纤维素合酶1(CESA1)基因序列，设计CESA1-gRNA,建立一步法获得表达gRNA的p201N-Cas9载体，作为后期鹅掌楸纤维素合酶基因编辑研究的载体工具。1结果与分析1.1PCR检测本试验选取对1号单克隆菌液提取的重组质粒进行PCR扩增，用2组引物均可以扩增得到相应大小的片段，与预期的条带大小一致，证实其为阳性重组子(图1)。1.2测序基因编辑的效率与gRNA序列有关。将阳性菌液送样测序，重复测序3次，证实插入的gRNA序列图1重组质粒及其PCR检测电泳分析注:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1和2代表p201N-Cas9-CESA1-gRNA质粒;3和4分别代表引物1和引物2Figure1RecombinantplasmidanditsPCRdetectionelec-trophoresisanalysisNote:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1and2representedp201N-Cas9-CESA1-gRNAplasmid;3and4representedprimer1andprimer22196
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用[J]. 蒲强,罗嘉,沈林園,李强,张谊,张顺华,朱砺. 中国生物工程杂志. 2015(11)
[2]CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J]. 康峰,卢胜明,张海峰. 实验动物科学. 2014(04)
[3]CRISPR-Cas介导的基因编辑工具[J]. 左其生,李东,张亚妮,李碧春. 生物技术通报. 2014(07)
[4]基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J]. 王梦瑶,杨亦农,边红武. 中国生物化学与分子生物学报. 2014(05)
[5]CRISPR-Cas基因组改造技术研究进展[J]. 颜雯,李海涛,向华,王晓虎. 广东农业科学. 2014(02)
[6]一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J]. 刘思也,夏海滨. 中国生物工程杂志. 2013(10)
[7]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[8]CRISPR结构与功能研究进展[J]. 杨超杰,邱少富,宋宏彬. 军事医学. 2013(02)
[9]成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR的研究进展[J]. 王丽丽,何进,王阶平. 微生物学报. 2011(08)
[10]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
硕士论文
[1]鹅掌楸纸浆林种源选择与生长过程研究[D]. 骆羿.中南林业科技大学 2007
本文编号：3507183
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3507183.html
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