CRISPR-Cas9系统：应用于酿酒酵母的一步多靶点基因编辑技术
发布时间：2021-11-22 02:39
随着DNA合成和测序的快速发展,菌株改造开始成为代谢工程和合成生物学中的限速步骤。我们开发了一种称为gRNA-tRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9（GTR-CRISPR）的系统,用tRNA序列将多个gRNA串联起来表达,极大提高了在酿酒酵母中的基因编辑数目和效率。利用此系统,在获得引物后7天内,能够构建出质粒并同时编辑8个基因,效率为87%,为目前世界上在酿酒酵母中编辑效率最高和数目最多的基因编辑体系。我们进一步开发了一种更快捷的GTR-CRISPR系统,通过将Golden Gate反应液直接转化入酵母,跳过了大肠杆菌中的构建质粒步骤,极大地节约了时间。利用快速方法,我们能够在获得引物后3天内同时编辑6个基因,效率为60%,即使是未优化的gRNAs效率也能达到23%。我们利用该系统来简化酵母脂质代谢网络,仅在10天内就完成了对8个基因的删除,提高了游离脂肪酸产量约30倍。
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统的原理示意图??
?第一章绪论???１．５?ｇＲＮＡ的两种表达策略??如今表达多种ｇＲＮＡ?—共有两种方法（图１－２）：图ａ是用单个ＲＮＡ聚合酶启动??子转录每个ｇＲＮＡ元件；图ｂ是使用单一的启动子在单一转录物中转录所有ｇＲＮＡ，??然后通过不同的方式处理释放单个ｇＲＮＡ。这个策略要求每个ｇＲＮＡ侧翼具有可切割??的ＲＮＡ序列，例如自切割核酶序列（例如Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ核酶和ＨＤＶ核酶），外??源切割因子识别序列Ｃ例如Ｃｙｓ４）?［７１和内源ＲＮＡ加工序列（例如ｔＲＮＡ序列和内含??子）［８?３１％。目前在酿酒酵母中，己经报道了在一个构建体上最多５个ｇＲＮＡ的表达【５］。??制定进一步提高多重基因编辑效率的策略将有利于应用研宂，如构建代谢细胞工厂和??基础研究，如产生最小的基因组。在本课题中我们会通过这两种策略来研究不同的??ｇＮＲＡ表达系统，从而找到最优的系统对酿酒酵母进行多基因同时编辑。??３?ｇＲＮＡ表达元件?ｂ?单转录后表达??ｉｐ〇ｉｗｄ＞１?￣￣ｆｅｍｒｅｏ￣ｈＷｗｐＭｆｆｌｉ?丨丁?ｉＰｏｉｉｉｉｐｒａｉｗｔｔＯｌ￣￣ｙ?．龜丨．．ＣＴＺ］?ｔｔｄ?］Ｔ??唇辱??ｎＢＲＮＡ１?（＼９ＲＮＡ２?ｇＲＮＡ１?ｇＲＮＡ２?ｇＲＮＡ３?ｇＲＮＡ４??３ｉｉｉｌＬｕｕｕｕｕｕ??＜＾ＲＮＡ３?Ｃ＼ＴＮＡ４?初级转录?纟?ＲＮａｓｅＰ??ＪＬｓｓｌ?）Ｕｉ．?麵?舰?舰??畢??Ｃａｓ９?、ｇＲＮＡ１?ｘ？ＲＮＡ２?ＪＪＲＮＡ３?．?ｇＲＮＡ４?Ｗｄ］?ｆｌＲＮＡ??ｉａＬ?ｊＬｉｆｉ．?ＪＬｓｌ．?ＪＬｓＬ??图１－２?ｇＲＮＡ的两种表达策略??左图是单个ＲＮＡ聚合酶启动子转录每个ｇＲＮＡ
?第一章绪论???ｂｐ作为靶向序列。??１．８?Ｄｏｎｏｒ的设计与制备??当ＣＲＩＳＰＲ系统对酵母基因组切割之后，我们通过加入的ｄｏｎｏｉ？来对基因组进行??编辑。在这个过程中，我们可以对基因进行移码突变使其无法正常表达，也可以删除??基囚的ＯＲＦ，还可以整合新的基因到叻割位点中，这主要看如何对ｄｏｎｏｒ进行设计。??Ｄｏｎｏｒ引物主要在ＧＥＮＥＷＩＺ公司中使用标准脱盐纯化方法合成，杂交熔解温度（Ｔｍ）??约为５５?°Ｃ?（图１－３）。ＰＣＲ反应后，我们通过乙醇沉淀对ｄｏｎｏｒ进行纯化。不是营养??缺陷型的供体ＤＮＡ在设计时加入了?Ｘｂａｌ位点（Ｔ＾ＣＴＡＧＡ），方便后续基因编辑结??果验证，其侧翼为同源修复序列？??二魏一????目标ｉ因?＞???目标基因?＞???＼?＼８ｂｐ／?／??！Ｌ！ｉ?ＭＩＣＨＨ！？?＂ｉＣＫＪｆａｐ?供体?ｆｆｌｆｆＴＯｆｆＷｉ．ｉ，ｉｉｉ?丨?ＸＵ?丨?１２０ｂｐｆ共体??ＰＣＨ２－６０ｔ＞ｐ?為蝝苷酸?ＰＣＲ?忙洎?２￣７０ｂｐ？５ＵＨ?鲅??图１－３?ＧＴＲ－ＣＲＩＳＰＲ系统的供体ＰＣＲ产生的图示??通过ＰＣＲ扩增两个寡核苷酸引物产生用于修复ＤＳＢ的供体。图ａ是基因８?ｂｐ删除供体ＤＮＡ的??设计，我们在８?ｂｐ基因的上下游各选择５０?ｂｐ的同源臂，通过两个寡核苷酸引物进行ＰＣＲ扩增：??图ｂ是基因ＯＲＦ缺失供体ＤＮＡ的设计，我们在靶标基因的ＯＲＦ上下游各选择了?６０?ｂｐ的同源臂，??通过两个寡核苷酸引物进行ＰＣＲ扩增??Ｆｉｇ?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｏｎｏｒ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＧＴＲ
本文编号：3510765
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统的原理示意图??
?第一章绪论???１．５?ｇＲＮＡ的两种表达策略??如今表达多种ｇＲＮＡ?—共有两种方法（图１－２）：图ａ是用单个ＲＮＡ聚合酶启动??子转录每个ｇＲＮＡ元件；图ｂ是使用单一的启动子在单一转录物中转录所有ｇＲＮＡ，??然后通过不同的方式处理释放单个ｇＲＮＡ。这个策略要求每个ｇＲＮＡ侧翼具有可切割??的ＲＮＡ序列，例如自切割核酶序列（例如Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ核酶和ＨＤＶ核酶），外??源切割因子识别序列Ｃ例如Ｃｙｓ４）?［７１和内源ＲＮＡ加工序列（例如ｔＲＮＡ序列和内含??子）［８?３１％。目前在酿酒酵母中，己经报道了在一个构建体上最多５个ｇＲＮＡ的表达【５］。??制定进一步提高多重基因编辑效率的策略将有利于应用研宂，如构建代谢细胞工厂和??基础研究，如产生最小的基因组。在本课题中我们会通过这两种策略来研究不同的??ｇＮＲＡ表达系统，从而找到最优的系统对酿酒酵母进行多基因同时编辑。??３?ｇＲＮＡ表达元件?ｂ?单转录后表达??ｉｐ〇ｉｗｄ＞１?￣￣ｆｅｍｒｅｏ￣ｈＷｗｐＭｆｆｌｉ?丨丁?ｉＰｏｉｉｉｉｐｒａｉｗｔｔＯｌ￣￣ｙ?．龜丨．．ＣＴＺ］?ｔｔｄ?］Ｔ??唇辱??ｎＢＲＮＡ１?（＼９ＲＮＡ２?ｇＲＮＡ１?ｇＲＮＡ２?ｇＲＮＡ３?ｇＲＮＡ４??３ｉｉｉｌＬｕｕｕｕｕｕ??＜＾ＲＮＡ３?Ｃ＼ＴＮＡ４?初级转录?纟?ＲＮａｓｅＰ??ＪＬｓｓｌ?）Ｕｉ．?麵?舰?舰??畢??Ｃａｓ９?、ｇＲＮＡ１?ｘ？ＲＮＡ２?ＪＪＲＮＡ３?．?ｇＲＮＡ４?Ｗｄ］?ｆｌＲＮＡ??ｉａＬ?ｊＬｉｆｉ．?ＪＬｓｌ．?ＪＬｓＬ??图１－２?ｇＲＮＡ的两种表达策略??左图是单个ＲＮＡ聚合酶启动子转录每个ｇＲＮＡ
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