利用改进的CRISPR/Cas9技术靶向突变三个水稻MAPK基因的研究
发布时间：2021-11-27 21:51
植物在遭受病虫害等生物胁迫时,外界的胁迫信号可以通过信号传导途径传递到植物细胞内,激活抗逆相关基因的表达。MAPK蛋白激酶广泛参与植物对胁迫信号的传递,是调控植物抗性的关键基因。近年来,随着CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated Protein）系统的快速发展,该技术被广泛应用于生物学研究和应用中。而在基因组编辑的实践中,g RNA的表达是CRISPR技术的难点之一。为了构建更加高效的CRISPR载体用于作物的抗病等研究,我们创建了一种新的方法来表达CRISPR/Cas9技术所需的g RNA和Cas9两个元件。本研究验证了该方法能够高效率的同时编辑多个水稻基因,并获得了抗病相关基因的靶向突变材料,取得的主要结果如下。（1）序列分析结果表明,本实验室前期构建CRISPR载体所用的水稻UBI10（Ubiquitin10）基因的启动子的5’-UTR（untranslated region）包含了一个内含子,该内含子具有典型的5’-GU-A-AG-3’的剪接序列...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
UBI10基因和本研究所有载体结构示意图
图 2. 基于内含子表达 gRNA 的 inPTG-Cas9 融合基因的原理。A. 细胞中 mRNA 成熟过程中内含子剪接示意图。B. 利用 PTG 表达多个 gRNA 的原理图 (Xie et al 2015)。PTG 在细胞内表达后，内源 RNase P 和 RNase Z 能够特异性识别并切割 tRNA，从而释放 gRNAs。C. inPTG-Cas9 的结构和原理。将含 PTG 的内含子与 Cas9 融合为一个基因，该基因转录后，在 mRNA 成熟过程中，内含子在细胞内的剪接 (splicing) 后与编码 Cas9 的成熟 mRNA 分开，内含子中的 PTG 中的 tRNA 被在RNase P 和 RNase Z 精确切割并释放所有的 gRNA。含 PTG 的内含子与编码 Cas9 的外显子融合形成 inPTG-Cas9，实现在一个基因中表达 CRISPR 所有元件。Figure 2. Engineering the intron to express polycistronic tRNA-gRNA (PTG) with Cas9 formultiplex genome editing.A. Schematic illustration of intron splicing from primary mRNA.B. Schematics of PTG processing to release individual gRNAs. The endogenous RNase P and Z specifically recognizeand precisely cut the tRNA unit in the PTG transcript to release gRNAs.C. The schematic depiction of the strategy to engineer the intron to express gRNAs for multiplex genome editing. Afterintegrating the PTG between the donor and branch sites of an intron, the gRNAs are cut out from the spliced intron byendogenous RNase P and Z, while the mature mRNA is translated as normal. The intronic PTG can be fused with Cas9
利用改进的 CRISPR/Cas9 技术靶向突变三个水稻 MAPK 基因的研究载体作为阳性对照，以 GFP 质粒载体作为阴性对照。RT-PCR 反应模板包括转染了pRGEB32-PTG6/PTG10 、 pRGEB33-inPTG6/inPTG10 、 pRGEB34-inPTG6/inPTG10载体的水稻原生质体 RNA。图 3 中 RT-PCR 结果显示，UBI10p::Cas9 和UBI10p::inPTG-Cas9 都能够扩增出相同大小的条带，初步表明 inPTG 不影响内含子的正常剪接。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物CRISPR基因组编辑技术的新进展[J]. 李红,谢卡斌. 生物工程学报. 2017(10)
[2]Plant innate immunity in rice:a defense against pathogen infection[J]. Wende Liu,Guo-Liang Wang. National Science Review. 2016(03)
本文编号：3523111
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
UBI10基因和本研究所有载体结构示意图
图 2. 基于内含子表达 gRNA 的 inPTG-Cas9 融合基因的原理。A. 细胞中 mRNA 成熟过程中内含子剪接示意图。B. 利用 PTG 表达多个 gRNA 的原理图 (Xie et al 2015)。PTG 在细胞内表达后，内源 RNase P 和 RNase Z 能够特异性识别并切割 tRNA，从而释放 gRNAs。C. inPTG-Cas9 的结构和原理。将含 PTG 的内含子与 Cas9 融合为一个基因，该基因转录后，在 mRNA 成熟过程中，内含子在细胞内的剪接 (splicing) 后与编码 Cas9 的成熟 mRNA 分开，内含子中的 PTG 中的 tRNA 被在RNase P 和 RNase Z 精确切割并释放所有的 gRNA。含 PTG 的内含子与编码 Cas9 的外显子融合形成 inPTG-Cas9，实现在一个基因中表达 CRISPR 所有元件。Figure 2. Engineering the intron to express polycistronic tRNA-gRNA (PTG) with Cas9 formultiplex genome editing.A. Schematic illustration of intron splicing from primary mRNA.B. Schematics of PTG processing to release individual gRNAs. The endogenous RNase P and Z specifically recognizeand precisely cut the tRNA unit in the PTG transcript to release gRNAs.C. The schematic depiction of the strategy to engineer the intron to express gRNAs for multiplex genome editing. Afterintegrating the PTG between the donor and branch sites of an intron, the gRNAs are cut out from the spliced intron byendogenous RNase P and Z, while the mature mRNA is translated as normal. The intronic PTG can be fused with Cas9
利用改进的 CRISPR/Cas9 技术靶向突变三个水稻 MAPK 基因的研究载体作为阳性对照，以 GFP 质粒载体作为阴性对照。RT-PCR 反应模板包括转染了pRGEB32-PTG6/PTG10 、 pRGEB33-inPTG6/inPTG10 、 pRGEB34-inPTG6/inPTG10载体的水稻原生质体 RNA。图 3 中 RT-PCR 结果显示，UBI10p::Cas9 和UBI10p::inPTG-Cas9 都能够扩增出相同大小的条带，初步表明 inPTG 不影响内含子的正常剪接。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物CRISPR基因组编辑技术的新进展[J]. 李红,谢卡斌. 生物工程学报. 2017(10)
[2]Plant innate immunity in rice:a defense against pathogen infection[J]. Wende Liu,Guo-Liang Wang. National Science Review. 2016(03)
本文编号：3523111
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3523111.html
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