烟曲霉Bem46基因荧光定位菌株构建及对极性生长相关基因影响作用初探

发布时间：2021-12-10 12:18

　　目的构建以eGFP作为荧光标记的烟曲霉Bem46基因定位菌株,观察其在烟曲霉不同形态中的定位情况,初步明确该基因对极性生长相关基因Bem1、Bud5表达的影响。方法运用分子生物学方法将烟曲霉Bem46基因克隆入质粒pUCGH,构建荧光定位载体。原生质体法转化烟曲霉获得该基因定位菌株并验证。激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉孢子、芽管以及菌丝状态下分布情况。RT-PCR观察对照菌株Ku80和ΔBem46中极性生长相关基因Bem1、Bud5的表达量。结果通过全基因克隆成功获得烟曲霉Bem46基因定位菌株并经PCR验证。激光共聚焦显微镜下绿色荧光在孢子中弥散分布,在孢子即将发芽时荧光在孢子一侧聚集,并随着芽管形成,荧光在极性生长的一侧延伸分布于整个菌丝中,在菌丝形成侧枝膨大处可见荧光明显聚集。RT-PCR结果表明ΔBem46中基因Bem1、Bud5表达量均较对照菌株有所下降。结论烟曲霉Bem46基因可能同孢子发芽、菌丝发生侧枝的极性生长相关;且该基因缺陷可影响极性生长相关基因Bem1、Bud5表达。 

【文章来源】：中国人兽共患病学报. 2020,36(10)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

利用含有荧光定位标记eGFP的质粒pUCGH构建荧光定位株载体示意图

将Bem46基因正确成功连接入质粒pUCGH后进行Bem46基因测序,确保正确的基因序列被克隆。由图2可见测序结果为整齐单一序列峰,且同烟曲霉基因组中Bem46基因序列比对完全符合。2.2.2 荧光定位菌株转化子PCR验证结果

表3 烟曲霉Bem46基因荧光定位菌株验证使用引物及相应片段大小Tab.3 Primer and corresponding fragment size used for identification of Bem46 gene fluorescence localization strain 引物组别 引物 Ku80(WT) Ku80 Bem46+GFP/kb I pUCGH-R No band 1.2 Bem46-KpnI-F II Hyg-Screen-F No band 1.0 Bem46-term HindIII-R III Bem46-KpnI-F 2.3kb 7.2 Bem46-term HindIII-R由表3可见引物I中烟曲霉Bem46定位菌株转化子扩增条带约1.2 kb,而对照菌株无条带出现,在图3 I中转化子1、2、3、4、5、6有正确大小的条带,说明有筛选标记eGFP同目的基因Bem46相连接。引物II荧光定位菌株应有扩增条带约1.0 kb,而对照菌株没有,在图3 II中可见到转化子1、2、3、4、5、6有筛选标记潮霉素同目的基因Bem46下游1.0 kb序列相连接。引物III扩增整个基因、连接入的质粒及下游1.0 kb序列,在对照菌株无质粒的连接,条带为2.3 kb,而在转化子由于有质粒连接进入故条带明显增大,为7.2 kb,图3 III中说明转化子1、2、3、4、5、6均为正确的转化子,有质粒成功连接进入。 通过I、II和III对引物验证表明转化子1、2、3、4、5、6均为构建成功的荧光定位菌株,可用来进行下一步实验。

【参考文献】：
期刊论文
[1]烟曲霉Bem46基因敲除株构建及其功能初步研究[J]. 李雯,李佳娟,冯文莉,马彦.  中国人兽共患病学报. 2017(08)



本文编号：3532617