核盘菌转录因子Ss-Fkh1基因功能研究

发布时间：2017-05-11 01:10

  本文关键词：核盘菌转录因子Ss-Fkh1基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)在农业生产上经常造成巨大的经济损失,可在全球范围内引发菌核病,因寄主范围广泛,可引起多种寄主减产甚至绝产。核盘菌为丝状真菌,菌丝聚集而形成菌核,使核盘菌度过不良环境,同时菌核也是核盘菌由无性生殖过度到有性生殖过程中重要的生理结构,因而对于菌核的防治成为控制该病害的关键。Forkhead-box转录因子家族在生命体成熟过程中有不可替代的功能,在生长发育、细胞分裂以及真菌致病性等多方面都起到重要的调节作用,因而对于该转录因子家族的研究显得非常有必要。本研究中克隆得到Forkhead-box转录因子家族中的Ss-Fkh1基因,分别用沉默载体p Silent、p Silent-Dual构建了沉默重组质粒,并利用原生质体转化的方法将重组质粒转入到核盘菌中,经相应抗性平板上的三次纯化筛选后,提取阳性转化子的DNA,在以所得到的DNA为模板克隆相应抗性基因,通过q RT-PCR分析Ss-Fkh1在不同沉默子中的表达量,实验结果显示与野生菌株不同,Ss-Fkh1在沉默子中的表达量均有下调,但不同的沉默子下降的程度有所不同。将得到的沉默转化子接种到PDA上进行培养七天后观察,与野生型菌株相比,沉默转化子单位时间内的生长量明显变慢,甚至不能铺满整个玻璃培养皿。菌丝形态观察结果表明,有些沉默转化子其菌丝分支角度不再是锐角,而是直角,与野生菌株有所区别。番茄叶片离体测试数据同样表明,沉默转化子的致病能力与野生菌株相比有不同程度减弱。野生型核盘菌与沉默转化子土豆泥培养基对峙培养7天后可以明显的看到当野生型核盘菌已经形成成熟的菌核时,此时沉默转化子仍然没有任何菌核的形成。q RT-PCR检测与黑色素形成相关基因在沉默转化子中的表达量,与野生型核盘菌相比转化子中目的基因的表达量大幅度下降,而核盘菌菌核的形成需要黑色素的沉积,如果没有黑色素的沉积则无法形成正常的菌核,如果没有菌核参与到核盘菌的生活史,由核盘菌引起植物病害的几率将会大大的降低,逆境生长速率测定结果表明沉默转化子对于逆境的耐性弱于野生型核盘菌。本研究通过基因沉默的方法研究Ss-Fkh1基因在核盘菌菌丝生长,菌落形态,致病性、菌核形成等过程中的功能以及对逆境的抵抗能力,为核盘菌的防治提供科学依据和理论支持。
【关键词】：核盘菌 转录因子 Ss-Fkh1 基因沉默 菌核
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.44
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-25
• 1 核盘菌简介12-17
• 1.1 核盘菌的分类，生活史及其侵染循环13-15
• 1.2 菌核病病害症状15-16
• 1.3 菌核病的危害及防治16-17
• 2 核盘菌菌核发育17-20
• 2.1 影响核盘菌菌核发育的因素18-20
• 3 丝状真菌基因功能研究进展20-23
• 3.1 RNA干扰技术20-22
• 3.2 转座子标签技术22
• 3.3 超表达技术22
• 3.4 基因敲除22-23
• 4 Forkhead-box转录因子研究进展23-24
• 5 本研究的目的和意义24-25
• 第二章 核盘菌Ss-Fkh1基因克隆及RNA干扰载体的构建25-37
• 1 材料25-26
• 1.1 菌株及载体25
• 1.2 主要仪器25
• 1.3 主要试剂25-26
• 1.4 培养基配制及试剂配制26
• 2 方法26-33
• 2.1 Ss-Fkh1基因克隆26-31
• 2.2 Ss-Fkh1 RNA干扰载体的构建31-33
• 2.3 Ss-Fkh1 RNA干扰载体的验证33
• 3 结果与分析33-35
• 3.1 PCR克隆连入两种载体的Ss-Fkh1片段33-34
• 3.2 重组质粒酶切鉴定结果34-35
• 4 小结35-37
• 第三章 筛选核盘菌Ss-Fkh1遗传转化子37-48
• 1 材料37-38
• 1.1 载体及菌株37
• 1.2 主要试剂37
• 1.3 主要试剂的配制37-38
• 2 方法38-43
• 2.1 制备核盘菌菌丝的原生质体38-40
• 2.2 PEG-Ca Cl2介导核盘菌原生质体的遗传转化40
• 2.3 2xCTAB提取液配制：40
• 2.4 pSD-Ss-Fkh1、p S1-Ss-Fkh1, 沉默转化子的筛选40-41
• 2.5 转化子PCR检测41-43
• 3 结果与分析43-47
• 3.1 菌丝培养43-44
• 3.2 原生质体制备44
• 3.3 转化子PCR初步检测44-47
• 4.小结47-48
• 第四章 转录因子Ss-Fkh1的功能验证48-65
• 1 材料48-49
• 1.1 菌株48
• 1.2 主要试剂48
• 1.3 试剂配制48-49
• 2 方法49-53
• 2.1 野生型核盘菌中Ss-Fkh1表达量分析49
• 2.2 沉默转化子菌丝形态观察49
• 2.3 沉默转化子菌落形态观察49
• 2.4 沉默转化子菌丝生长速率测定49-50
• 2.5 野生型核盘菌与沉默转化子对峙培养50
• 2.6 黑色素相关基因表达量分析50-51
• 2.7 沉默转化子致病力的测定51-52
• 2.8 沉默转化子对过氧化氢耐力测定52
• 2.9 沉默转化子对高盐环境的耐力测定52-53
• 3 结果与分析53-63
• 3.1 野生型核盘菌中Ss-Fkh1表达量分析53
• 3.2 沉默转化子菌丝形态观察53-54
• 3.3 沉默转化子菌落形态观察结果54-55
• 3.4 沉默转化子菌丝生长速率测定55-56
• 3.5 野生型核盘菌与沉默转化子对峙培养56-57
• 3.6 黑色素相关基因表达量分析57-59
• 3.7 沉默转化子致病力的测定59-60
• 3.8 沉默转化子对过氧化氢耐力测定60-62
• 3.9 沉默转化子对高盐环境的耐力测定62-63
• 4 小结63-65
• 结论65-66
• 参考文献66-71
• 致谢71-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：355906