苹果果锈形成关键基因筛选及MdLIM11功能鉴定
发布时间：2022-01-07 03:04
苹果果锈是一种非侵染性生理病害,在我国多数苹果产区和多数主栽品种中均有发生,对苹果的产量以及品质造成严重影响。目前,对苹果果实套袋是防止果锈发生的有效措施之一,但该措施不利于我国苹果产业的可持续发展。开展苹果中参与果锈形成的关键基因挖掘及其功能研究工作,对于进一步创制无锈苹果新种质具有重要意义。前人研究结果表明,果锈的发生与木质素和木栓质的积累有关,并且筛选得到一些调控木栓质生物合成的转录因子,但对于果锈中调控木质素生物合成的转录因子还未见报道。本研究以花后30 d、60 d和150 d的套袋和非套袋‘金冠’苹果为试材,利用组织学、转录组学、蛋白质组学以及关联分析,并且针对筛选得到的调控木质素生物合成的转录因子进行功能验证,得出的主要研究结果如下:1.组织学分析结果表明,套袋‘金冠’无果锈产生,而非套袋‘金冠’苹果在花后30 d时果皮开始形成微裂隙,表皮细胞开始破裂;在花后60 d时微裂隙进一步加深,形成“V”型裂痕,果锈组分开始积累;在花后150 d时“V”型裂缝变得更长、更深,果锈成分大量沉积。2.转录组数据分析显示,三个时期共有的DEGs为273个,其中有77个上调表达,196个...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
转录组建库测序和基本的分析过程
中国农业科学院博士学位论文第二章基于转录组和蛋白质组关联分析筛选苹果果锈形成相关基因15图2-2蛋白质组实验步骤Fig.2-2Theexperimentprocedureofproteome2.1.5.2蛋白提娶质控、酶解1)称取0.8g左右果皮，剪碎后分装到2mL小离心管中，随后加10%PVPP和5mm磁珠，再加1.5mLLysisBuffer、1mM的PMSF、2mM的EDTA，置于冰上5min后，加入终浓度为10mMDTT；2)利用组织研磨仪破碎组织（功率=60HZ，time=120s），取出磁珠，25,000g离心20min；3)将上清液移入50mL离心管中，加5倍体积的冷TCA和终浓度为10mM的DTT，破碎沉淀并于-20°C静置2h，次日离心，留沉淀；4)将上述沉淀移入2mL离心管中，加1mL冷丙酮、终浓度10mMDTT，于-20℃放置30min后，离心弃上清；5)重复（4）三次至上清无色；6)加一颗5mm磁珠，采用组织研磨仪震荡蛋白液（time=120S、功率=40HZ），离心取上清；7)加终浓度10mMDTT，56℃水浴1h，加终浓度55mMIAM黑暗放置45min；8)加5倍体积的冷丙酮沉淀样品2h，离心后弃上清；9)风干沉淀并加入Buffer溶解；10)采用组织研磨仪震荡蛋白液（time=120s、功率=40HZ），离心，上清液即为蛋白质溶液。11)酶标仪下读取每个样品的OD595数值，用以检测蛋白浓度。12)每个样品取100μg蛋白溶液，按蛋白:酶=40:1的比例加入2.5μg酶，37℃酶解4h，并利用StrataX柱除盐。2.1.5.3肽段标记及分组
中国农业科学院博士学位论文第二章基于转录组和蛋白质组关联分析筛选苹果果锈形成相关基因17iTRAQ数据的定量采用华大自主研发的IQuant（WENetal.,2014）软件。首先在谱图/肽段水平进行1%FDR的过滤（PSM-levelFDR≤0.01），从而获得显著性鉴定的谱图和肽段列表。随后利用肽段进行蛋白组装，并产生一系列的蛋白组。在蛋白水平上以FDR1%再次进行过滤（Protein-levelFDR≤0.01）以控制蛋白的假阳性率，。表2-3IQuant定量参数Table2-3IQuantquantitationparametersItemValueQuant_peptideUseAllUniquepeptideQuant_numberAtleastoneuniquespetraProtein_RatioWeightedaverageStatisticalAnalysisPermutationTests2.1.5.7差异蛋白GO富集及Pathway富集分析在单个样品中，定义FC≥1.2，并且Q-value＜0.05的蛋白为DEP。对多次重复试验数据，最终差异蛋白需至少在2次重复数据中被定义为差异蛋白。对于DEPs的GO富集分析，利用显著差异蛋白和全部鉴定得到的蛋白进行比对之后，再使用超几何检验筛选显著富集的GOterm；差异蛋白的Pathway富集分析原理类似于此。超几何检验的公式与DEPs的pvalue计算方法一致。2.1.6转录组学和蛋白质组学关联分析蛋白质组与转录组数据关联分析的基本原理为中心法则，基于基因表达信息流情况，在mRNA水平以及蛋白质水平开展测序工作，然后将两组学的数据进行整合分析，观测基因表达过程。基于数据不同分类和关联层次的不同，关联分析流程如图2-3所示。图2-3关联分析流程图Fig.2-3Procedureforcorrelationanalysisofproteomeandtranscriptome
【参考文献】：
期刊论文
[1]苹果SLAF图谱构建及果锈基因QTL分析[J]. 张朝红,陈东玫,杨凤秋,赵同生,李扬,赵国栋,赵永波. 华北农学报. 2019(05)
[2]大豆抗豆卷叶螟的转录组和蛋白质组关联分析[J]. 曾维英,孙祖东,赖振光,蔡昭艳,陈怀珠,杨守臻,唐向民. 中国农业科学. 2018(07)
[3]苹果片在干制条件下的蛋白质组学分析[J]. 李新明,李群,韩彦龙,高忠东,王峰,田志芳,徐琳,王贤萍,刘森. 安徽农业科学. 2018(02)
[4]高油酸油菜脂肪酸代谢的蛋白质组学与转录组学关联分析[J]. 王晓丹,肖钢,常涛,张振乾,官春云,邬贤梦. 华北农学报. 2017(06)
[5]转录组与蛋白质组关联分析鉴定桑树硬枝扦插皮部生根相关功能基因[J]. 杜小龙,曹旭,刘利,殷朝瑞,班月圆,李建龙,程嘉翎. 蚕业科学. 2017(03)
[6]苹果褐斑病菌侵染苹果属山定子的转录组学分析[J]. 李海录,宋艳艳,冯浩,黄丽丽,强晓玉,韩青梅. 农业生物技术学报. 2017(01)
[7]苹果叶片应答轮纹病菌胁迫的叶绿体蛋白质组学分析[J]. 肖龙,张彩霞,宗泽冉,田义,张利义,丛佩华. 果树学报. 2016(11)
[8]拟南芥AAP基因家族的生物信息学分析[J]. 范贝,刘明晓,李慧杰,张雪,王晓梅,崔喜艳. 生命的化学. 2016(03)
[9]棉花LIM蛋白基因家族的进化及表达特征分析[J]. 杨洋,李波,胡文冉,张经博,范玲. 植物生理学报. 2015(12)
[10]苹果果锈发生机制及防控技术研究进展[J]. 李壮,厉恩茂,袁继存,安秀红,李敏,程存刚. 北方园艺. 2015(22)
博士论文
[1]丹参漆酶及菘蓝转录因子WRKY34的功能研究[D]. 冯婧娴.中国人民解放军海军军医大学 2019
[2]龙眼体胚发生早期转录组与蛋白质组学分析及开花时间相关基因表达与功能分析[D]. 陈裕坤.福建农林大学 2018
[3]苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的筛选[D]. 周喆.中国农业科学院 2018
[4]杨树转录因子MYB6调控类黄酮和木质素生物合成的机制研究[D]. 汪丽君.西南大学 2018
[5]黑腐皮壳侵染苹果的组织细胞学及转录组学研究[D]. 柯希望.西北农林科技大学 2013
硕士论文
[1]不套袋对苹果品质的影响及果锈产生主要因素分析[D]. 张瑞芳.西北农林科技大学 2019
[2]南方型紫花苜蓿耐盐突变体响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析[D]. 张婧蕾.浙江农林大学 2018
[3]高粱转录因子SbbHLH1调控木质素合成代谢网络的初步研究[D]. 董江艳.山东大学 2018
[4]转录组和蛋白质组关联分析‘无子瓯柑’雄性不育分子机理[D]. 俞狄虎.浙江农林大学 2018
[5]山楂木质素合成相关转录因子MYB46的基因克隆及功能验证[D]. 苏悦.沈阳农业大学 2016
[6]苹果HD-ZipⅠ转录因子鉴定及表达分析[D]. 亢键.西北农林科技大学 2014
本文编号：3573679
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
转录组建库测序和基本的分析过程
中国农业科学院博士学位论文第二章基于转录组和蛋白质组关联分析筛选苹果果锈形成相关基因15图2-2蛋白质组实验步骤Fig.2-2Theexperimentprocedureofproteome2.1.5.2蛋白提娶质控、酶解1)称取0.8g左右果皮，剪碎后分装到2mL小离心管中，随后加10%PVPP和5mm磁珠，再加1.5mLLysisBuffer、1mM的PMSF、2mM的EDTA，置于冰上5min后，加入终浓度为10mMDTT；2)利用组织研磨仪破碎组织（功率=60HZ，time=120s），取出磁珠，25,000g离心20min；3)将上清液移入50mL离心管中，加5倍体积的冷TCA和终浓度为10mM的DTT，破碎沉淀并于-20°C静置2h，次日离心，留沉淀；4)将上述沉淀移入2mL离心管中，加1mL冷丙酮、终浓度10mMDTT，于-20℃放置30min后，离心弃上清；5)重复（4）三次至上清无色；6)加一颗5mm磁珠，采用组织研磨仪震荡蛋白液（time=120S、功率=40HZ），离心取上清；7)加终浓度10mMDTT，56℃水浴1h，加终浓度55mMIAM黑暗放置45min；8)加5倍体积的冷丙酮沉淀样品2h，离心后弃上清；9)风干沉淀并加入Buffer溶解；10)采用组织研磨仪震荡蛋白液（time=120s、功率=40HZ），离心，上清液即为蛋白质溶液。11)酶标仪下读取每个样品的OD595数值，用以检测蛋白浓度。12)每个样品取100μg蛋白溶液，按蛋白:酶=40:1的比例加入2.5μg酶，37℃酶解4h，并利用StrataX柱除盐。2.1.5.3肽段标记及分组
中国农业科学院博士学位论文第二章基于转录组和蛋白质组关联分析筛选苹果果锈形成相关基因17iTRAQ数据的定量采用华大自主研发的IQuant（WENetal.,2014）软件。首先在谱图/肽段水平进行1%FDR的过滤（PSM-levelFDR≤0.01），从而获得显著性鉴定的谱图和肽段列表。随后利用肽段进行蛋白组装，并产生一系列的蛋白组。在蛋白水平上以FDR1%再次进行过滤（Protein-levelFDR≤0.01）以控制蛋白的假阳性率，。表2-3IQuant定量参数Table2-3IQuantquantitationparametersItemValueQuant_peptideUseAllUniquepeptideQuant_numberAtleastoneuniquespetraProtein_RatioWeightedaverageStatisticalAnalysisPermutationTests2.1.5.7差异蛋白GO富集及Pathway富集分析在单个样品中，定义FC≥1.2，并且Q-value＜0.05的蛋白为DEP。对多次重复试验数据，最终差异蛋白需至少在2次重复数据中被定义为差异蛋白。对于DEPs的GO富集分析，利用显著差异蛋白和全部鉴定得到的蛋白进行比对之后，再使用超几何检验筛选显著富集的GOterm；差异蛋白的Pathway富集分析原理类似于此。超几何检验的公式与DEPs的pvalue计算方法一致。2.1.6转录组学和蛋白质组学关联分析蛋白质组与转录组数据关联分析的基本原理为中心法则，基于基因表达信息流情况，在mRNA水平以及蛋白质水平开展测序工作，然后将两组学的数据进行整合分析，观测基因表达过程。基于数据不同分类和关联层次的不同，关联分析流程如图2-3所示。图2-3关联分析流程图Fig.2-3Procedureforcorrelationanalysisofproteomeandtranscriptome
【参考文献】：
期刊论文
[1]苹果SLAF图谱构建及果锈基因QTL分析[J]. 张朝红,陈东玫,杨凤秋,赵同生,李扬,赵国栋,赵永波. 华北农学报. 2019(05)
[2]大豆抗豆卷叶螟的转录组和蛋白质组关联分析[J]. 曾维英,孙祖东,赖振光,蔡昭艳,陈怀珠,杨守臻,唐向民. 中国农业科学. 2018(07)
[3]苹果片在干制条件下的蛋白质组学分析[J]. 李新明,李群,韩彦龙,高忠东,王峰,田志芳,徐琳,王贤萍,刘森. 安徽农业科学. 2018(02)
[4]高油酸油菜脂肪酸代谢的蛋白质组学与转录组学关联分析[J]. 王晓丹,肖钢,常涛,张振乾,官春云,邬贤梦. 华北农学报. 2017(06)
[5]转录组与蛋白质组关联分析鉴定桑树硬枝扦插皮部生根相关功能基因[J]. 杜小龙,曹旭,刘利,殷朝瑞,班月圆,李建龙,程嘉翎. 蚕业科学. 2017(03)
[6]苹果褐斑病菌侵染苹果属山定子的转录组学分析[J]. 李海录,宋艳艳,冯浩,黄丽丽,强晓玉,韩青梅. 农业生物技术学报. 2017(01)
[7]苹果叶片应答轮纹病菌胁迫的叶绿体蛋白质组学分析[J]. 肖龙,张彩霞,宗泽冉,田义,张利义,丛佩华. 果树学报. 2016(11)
[8]拟南芥AAP基因家族的生物信息学分析[J]. 范贝,刘明晓,李慧杰,张雪,王晓梅,崔喜艳. 生命的化学. 2016(03)
[9]棉花LIM蛋白基因家族的进化及表达特征分析[J]. 杨洋,李波,胡文冉,张经博,范玲. 植物生理学报. 2015(12)
[10]苹果果锈发生机制及防控技术研究进展[J]. 李壮,厉恩茂,袁继存,安秀红,李敏,程存刚. 北方园艺. 2015(22)
博士论文
[1]丹参漆酶及菘蓝转录因子WRKY34的功能研究[D]. 冯婧娴.中国人民解放军海军军医大学 2019
[2]龙眼体胚发生早期转录组与蛋白质组学分析及开花时间相关基因表达与功能分析[D]. 陈裕坤.福建农林大学 2018
[3]苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的筛选[D]. 周喆.中国农业科学院 2018
[4]杨树转录因子MYB6调控类黄酮和木质素生物合成的机制研究[D]. 汪丽君.西南大学 2018
[5]黑腐皮壳侵染苹果的组织细胞学及转录组学研究[D]. 柯希望.西北农林科技大学 2013
硕士论文
[1]不套袋对苹果品质的影响及果锈产生主要因素分析[D]. 张瑞芳.西北农林科技大学 2019
[2]南方型紫花苜蓿耐盐突变体响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析[D]. 张婧蕾.浙江农林大学 2018
[3]高粱转录因子SbbHLH1调控木质素合成代谢网络的初步研究[D]. 董江艳.山东大学 2018
[4]转录组和蛋白质组关联分析‘无子瓯柑’雄性不育分子机理[D]. 俞狄虎.浙江农林大学 2018
[5]山楂木质素合成相关转录因子MYB46的基因克隆及功能验证[D]. 苏悦.沈阳农业大学 2016
[6]苹果HD-ZipⅠ转录因子鉴定及表达分析[D]. 亢键.西北农林科技大学 2014
本文编号：3573679
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