表达禽流感病毒HA基因重组鸭病毒性肠炎病毒诱导特异性快速免疫保护机制的研究

发布时间：2017-05-12 01:06

  本文关键词：表达禽流感病毒HA基因重组鸭病毒性肠炎病毒诱导特异性快速免疫保护机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科有囊膜多形态单股负链RNA病毒。该病毒严重威胁养禽业的健康发展和人类健康。AIV通过结构蛋白识别宿主细胞表面受体并与受体结合感染细胞,其中HA蛋白作为最重要的保护性抗原,已成为各类抗流感疫苗研究的靶蛋白。前期研究中,本实验室已成功构建表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭病毒性肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVus78Ha株,免疫鸭后可在鸭体内诱导产生对同源AIV坚固且快速的免疫保护,但其免疫机制仍不清楚。在高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染宿主细胞的过程中,HA蛋白的信号肽和跨膜区对其活性和表达都存在影响。为研究抗原不同递呈形式对疫苗保护效果的影响,本试验首先利用RedE/T同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将以SV40作为启动子的不同形式的HA基因编码序列插入DEV复制非必须区US7和US8之间,随后分别构建了表达缺失HA基因信号肽的重组DEV(rDEV-PK)和缺失HA基因跨膜区的重组DEV(rDEV-PSM);重组病毒拯救成功后,分别以rDEVus78Ha、rDEV-PK和rDEV-PSM对三周龄SPF鸭进行免疫,于免疫后3d和7d进行攻毒实验,对重组病毒rDEV-PK和rDEV-PSM的免疫保护能力进行评估。为研究rDEVus78Ha能够提供特异性快速免疫保护的机制,用其免疫三周龄SPF鸭,同时设置禽流感灭活疫苗Re-5株和PBS对照组,于免疫后1d、3d、5d、7d、14d分别采集脾脏、法氏囊、气管洗液、唾液和泪液,分离外周血淋巴细胞、脾脏淋巴细胞和血清,然后利用荧光定量PCR、流式细胞检测和间接ELISA等技术对重组DEV免疫后鸭体内的天然免疫和获得性免疫情况进行研究。试验结果表明:成功拯救了两株重组病毒rDEV-PK和rDEV-PSM,缺失HA基因信号肽的rDEV-PK表达的HA蛋白不能正常地转移到细胞膜上而在感染细胞内积聚,缺失HA基因跨膜区的重组rDEV-PSM表达的HA蛋白被分泌到细胞外,且HA基因信号肽或跨膜区的缺失均不影响重组病毒的复制;但重组病毒rDEV-PK和rDEV-PSM并不能诱导鸭产生对同源性HPAIV的特异性快速免疫保护作用;包含HA蛋白完整信号肽和跨膜区序列的重组病毒rDEVus78HA株免疫鸭后能在转录水平上调细胞因子IFN-γ、Granzyme-A的表达,增强淋巴细胞刺激增殖能力,诱导产生更多的CD4+T细胞,提高了机体细胞免疫应答的能力。本研究表明,HA蛋白的信号肽和跨膜区均是诱导机体产生特异性快速免疫应答的必须区域;而增强的细胞免疫应答可能是rDEVus78Ha能够诱导机体产生特异性快速免疫保护的关键因素。这为特异性快速免疫机制的研究和未来快速免疫疫苗的研究提供了参考和研究基础。
【关键词】：高致病性禽流感 重组鸭病毒性肠炎病毒 HA蛋白 荧光定量PCR 细胞因子
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Summary5-11
• 第一章绪论11-20
• 1.禽流感病毒概述12-17
• 1.1 流感病毒分子生物学研究进展12-13
• 1.2 H5N1亚型禽流感13-14
• 1.3 HA蛋白14-15
• 1.4 HA蛋白的信号肽与跨膜区15-16
• 1.5 禽流感病毒疫苗研究进展16-17
• 2.鸭病毒性肠炎病毒概述17-20
• 2.1 鸭病毒性肠炎病毒研究进展17-18
• 2.2 鸭病毒性肠炎病毒载体研究进展18-20
• 第二章表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭病毒性肠炎病毒的构建与鉴定20-38
• 1．材料与方法20-30
• 1.1 病毒株、重组质粒及细胞20
• 1.2 试剂与耗材20-21
• 1.3 主要仪器21-22
• 1.4 试验动物22
• 1.5 引物的设计合成22
• 1.6 表达缺失信号肽或跨膜区AIV HA基因重组质粒的构建22-25
• 1.7 重组粘粒T-us78HApk和T-us78HApsm的构建25
• 1.8 重组病毒的拯救25-28
• 1.9 重组病毒的鉴定28-29
• 1.10 重组病毒一步生长曲线的测定29
• 1.11 重组病毒的攻毒保护效力评估29-30
• 2．结果30-36
• 2.1 不同区域HA基因的扩增及重组质粒的鉴定30-31
• 2.2 重组病毒的成功拯救31-32
• 2.3 重组病毒的PCR鉴定32
• 2.4 重组病毒的IFA鉴定32-33
• 2.5 重组病毒的Western blot鉴定33-34
• 2.6 重组病毒的生长动力学曲线34
• 2.7 重组病毒的攻毒保护效力评估34-36
• 3．讨论36-38
• 第三章禽流感重组鸭病毒性肠炎病毒载体活疫苗在鸭体内诱导天然免疫情况研究38-51
• 1.材料与方法38-44
• 1.1 疫苗38
• 1.2 主要试剂38
• 1.3 主要仪器设备38-39
• 1.4 试验动物39
• 1.5 试验设计39
• 1.6 引物设计39
• 1.7 组织总RNA提取39-41
• 1.8 反转录41-42
• 1.9 质粒标准品的制备42-43
• 1.10 质粒标准品浓度的测定及拷贝数的计算43
• 1.11 荧光定量PCR43-44
• 1.12 标准品标准曲线的绘制44
• 1.13 方法性能评估44
• 1.14 细胞因子的表达定量44
• 2.结果44-48
• 2.1 标准曲线的绘制44-46
• 2.2 性能评估46-47
• 2.3 细胞因子mRNA表达定量47-48
• 3.讨论48-51
• 第四章禽流感重组鸭病毒性肠炎病毒载体活疫苗在鸭体内诱导获得性免疫情况研究51-56
• 1.材料与方法51-52
• 1.1 疫苗及动物51
• 1.2 主要试剂51-52
• 1.3 主要仪器设备52
• 1.4 方法52
• 2 结果52-55
• 2.1 淋巴细胞刺激增殖指数（SI）测定结果52-53
• 2.2 CD~(4+)淋巴细胞测定结果53-54
• 2.3 间接ELISA检测HA特异性抗体结果54-55
• 3．讨论55-56
• 第五章全文结论56-57
• 参考文献57-65
• 致谢65-66
• 作者简介66-67
• 导师简介67-68

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