利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

发布时间：2022-01-15 23:06

　　为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。 

【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(16)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

Bsr-d1基因结构及g RNA靶点位置

将携带Bsr-d1基因2个靶标的表达载体CRIS-PR-Cas9-BSRD1通过农杆菌转化恢复系籼稻‘GH9-98’后，共获得22株T0代转基因株系。用抗潮霉素基因引物Hyg-F/Hyg-R检测以筛选转基因阳性植株。结果发现22株T0代转基因植株都带有抗性基因，阳性率为100%。为了分析‘GH998’中Bsr-d1基因的突变情况，用引物BSRD1-F/BSRD1-R扩增基因，并对PCR产物进行测序分析。测序结果表明，有13株阳性转基因苗在靶标2处发生了突变，突变率为59.1%，其中有4株为纯合突变，占30.8%,9株为杂合突变，占69.2%；而在靶标1处没有检测到有突变的植株。靶标2处的突变基因型包括纯合突变和杂合突变，突变类型包括碱基插入和缺失，以碱基缺失为主，占61.5%(表2)。

为了分析‘GH998’中Bsr-d1基因的突变情况，用引物BSRD1-F/BSRD1-R扩增基因，并对PCR产物进行测序分析。测序结果表明，有13株阳性转基因苗在靶标2处发生了突变，突变率为59.1%，其中有4株为纯合突变，占30.8%,9株为杂合突变，占69.2%；而在靶标1处没有检测到有突变的植株。靶标2处的突变基因型包括纯合突变和杂合突变，突变类型包括碱基插入和缺失，以碱基缺失为主，占61.5%(表2)。图4 重组质粒CRISPR-Cas9-BSRD1的PCR验证

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3591483