青鱼IRF5基因的克隆及功能初探
发布时间：2022-01-21 11:14
青鱼是我国重要的淡水经济鱼类,但是自然和养殖环境的多种病原微生物对青鱼的养殖构成了严重威胁。本研究以青鱼IRF5（Black carp interferon regulated factor 5,bcIRF5）为研究对象,探究了bcIRF5在宿主及宿主细胞抗病毒先天性免疫过程中发挥的作用。本研究克隆了青鱼IRF5基因,并对青鱼IRF5基因进行了重组表达及功能分析,取得了如下结果:1.与其他动物的IRF5同源物相比,青鱼IRF5在序列和结构上具有高度的保守性,其氨基酸序列与同为鲤科鱼类的草鱼和斑马鱼IRF5的氨基酸序列具有极高的相似性,分别为99.6%和93.6%;而其两个重要结构域DNA结合区域（DNA banding domain,DBD）和IRF相关结构域（Interferon association domain,IAD）则极为保守;2.实时荧光定量PCR显示SVCV和GCRV能影响bcIRF5在不同组织中的表达,同时发现两种模拟刺激物（Poly（I:C）与LPS）和SVCV与GCRV这两种病毒也在宿主细胞MPK中影响bcIRF5的mRNA表达水平;3.蛋白质免疫印迹显示在EPC...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
bcIRF5的CDS区域
青鱼IRF5基因的克隆及功能初探27达没有显著差异外，在其他组织中bcIRF5的表达量均有显著上升；同时，我们发现bcIRF5对于SVCV和GCRV刺激的应答水平存在一定差距。SVCV处理组，在肠和肾脏中能检测到较高的bcIRF5的mRNA水平，分别为对照组（将检测到的最小表达实验组作为基准组，即PBS处理的肠(Intestine)）的12倍和11倍，而在心脏中则导致了其表达降低了2.2倍。而GCRV处理组则都在一定程度上上调了bcIRF5在不同组织中的表达，其中较为显著的是在肾脏、脾脏和心脏中，分别达到了基准组的19倍、9倍、和37倍见图3-4。以上结果说明了SVCV和GCRV对bcIRF5在不同组织中的表达有影响，即bcIRF5参与了青鱼抵御SVCV和GCRV的抗病毒防御过程，同时也表明机体对这两种病毒的抵御机制有一定差异。图3-4：bcIRF5在青鱼不同组织中的表达。对六月龄的青鱼（120g左右）分别处以SVCV（2.43×106pfu每条鱼）、GCRV（2.52×106pfu每条鱼）和无菌PBS（对照组）腹腔注射并于26℃饲养。每个注射组分别随机挑选三条鱼，在注射后33h分离并收集青鱼组织。将同一实验组中分别提取自同一实验组的三条鱼的各器官的总RNA合成为cDNA模板并进行实时荧光定量PCR检测。Fig3-4：theexpressionofbcIRF5indifferentorgansinblackcarp.Blackcarpofsixmonths(weightof120g)wasinjectedintraperitoneallywithSVCV(2.43×106pfuperfish),GCRV(2.52×106pfuperfish)orsterilePBS(controlgroup)separatelyandculturedat26°C.Threefishwererandomlyselectedfromeachinjectiongroup,andthetissueofblackcarpwasisolatedandcollectedat33hafterinjection.ThetotalRNAwhichwassynthesizedintoacDNAtemplateextractedfromeachorganofthreefishesinthesameexperimentalgroupanddetectedbyqPCR.
青鱼IRF5基因的克隆及功能初探29图3-5：MPK细胞中bcIRF5的表达。分别用不同浓度的Poly(I:C)（A）和LPS（B）或不同MOI的SVCV（C）和GCRV（D）刺激培养于六孔板中的青鱼肾细胞（2×106个细胞每孔），在图中所示的不同时间点收取细胞并提取其总RNA，然后再逆转为qPCR模板后检测bcIRF5mRNA的相对表达水平。Figure3-5:bcIRF5expressioninMPKcells.MPKcellsin6-wellplate(2×106cells/well)weretreatedwithPoly(I:C)(A)orLPS(B)atindicatedconcentrationseparately;orinfectedwithSVCV(C)orGCRV(D)atindicatedMOIseparately.CollectcellsatdifferenttimepointsandextracttheirtotalRNA,andthentherelativeexpressionlevelofbcIRF5mRNAwasdetectedafterreversingtoqPCRtemplate.3.5bcIRF5蛋白的表达为明确bcIRF5在体外培养的细胞系中的过表达情况，我们分别构建了pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag。我们选取了两种具有代表性的细胞系（EPC和HEK-293T细胞）来进行真核细胞过表达实验。我们的结果显示，不管是在这一常用的鱼类相关研究细胞系（EPC细胞）还是在HEK293T细胞这一高效表达外源基因的哺乳动物细胞系中，bcIRF5均能成功表达。在这两种细胞中，分别由pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag表达的蛋白条带大小均为65kDa，如图3-6。由于
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 张媛媛,宋理平. 河北渔业. 2018(02)
[2]鱼类免疫应答机制研究进展[J]. 白姗姗,贾智英,石连玉. 水产学杂志. 2017(04)
[3]鱼类的免疫及存在的问题(上)[J]. 孟思妤,孟长明,陈昌福. 科学养鱼. 2015(11)
[4]青鱼鱼病概况及其防治策略[J]. 吴宇略. 渔业致富指南. 2010(21)
[5]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 王俊相,李玉萍,孔令富,李莲军. 四川畜牧兽医. 2010(07)
[6]浅谈鱼类免疫系统[J]. 黄宁,陈学群. 福建畜牧兽医. 2005(06)
[7]Ⅰ型干扰素及其在抗病毒和抗细菌感染中的作用[J]. 陈刚,郑大海,杨仉生,程根宏,唐宏. 中国免疫学杂志. 2005(02)
[8]鱼类胸腺研究进展[J]. 谢海侠,聂品. 水产学报. 2003(01)
[9]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 孙德文,詹勇,许梓荣. 水利渔业. 2002(06)
[10]鱼类体液免疫因子研究进展[J]. 张永安,聂品. 水产学报. 2000(04)
本文编号：3600156
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
bcIRF5的CDS区域
青鱼IRF5基因的克隆及功能初探27达没有显著差异外，在其他组织中bcIRF5的表达量均有显著上升；同时，我们发现bcIRF5对于SVCV和GCRV刺激的应答水平存在一定差距。SVCV处理组，在肠和肾脏中能检测到较高的bcIRF5的mRNA水平，分别为对照组（将检测到的最小表达实验组作为基准组，即PBS处理的肠(Intestine)）的12倍和11倍，而在心脏中则导致了其表达降低了2.2倍。而GCRV处理组则都在一定程度上上调了bcIRF5在不同组织中的表达，其中较为显著的是在肾脏、脾脏和心脏中，分别达到了基准组的19倍、9倍、和37倍见图3-4。以上结果说明了SVCV和GCRV对bcIRF5在不同组织中的表达有影响，即bcIRF5参与了青鱼抵御SVCV和GCRV的抗病毒防御过程，同时也表明机体对这两种病毒的抵御机制有一定差异。图3-4：bcIRF5在青鱼不同组织中的表达。对六月龄的青鱼（120g左右）分别处以SVCV（2.43×106pfu每条鱼）、GCRV（2.52×106pfu每条鱼）和无菌PBS（对照组）腹腔注射并于26℃饲养。每个注射组分别随机挑选三条鱼，在注射后33h分离并收集青鱼组织。将同一实验组中分别提取自同一实验组的三条鱼的各器官的总RNA合成为cDNA模板并进行实时荧光定量PCR检测。Fig3-4：theexpressionofbcIRF5indifferentorgansinblackcarp.Blackcarpofsixmonths(weightof120g)wasinjectedintraperitoneallywithSVCV(2.43×106pfuperfish),GCRV(2.52×106pfuperfish)orsterilePBS(controlgroup)separatelyandculturedat26°C.Threefishwererandomlyselectedfromeachinjectiongroup,andthetissueofblackcarpwasisolatedandcollectedat33hafterinjection.ThetotalRNAwhichwassynthesizedintoacDNAtemplateextractedfromeachorganofthreefishesinthesameexperimentalgroupanddetectedbyqPCR.
青鱼IRF5基因的克隆及功能初探29图3-5：MPK细胞中bcIRF5的表达。分别用不同浓度的Poly(I:C)（A）和LPS（B）或不同MOI的SVCV（C）和GCRV（D）刺激培养于六孔板中的青鱼肾细胞（2×106个细胞每孔），在图中所示的不同时间点收取细胞并提取其总RNA，然后再逆转为qPCR模板后检测bcIRF5mRNA的相对表达水平。Figure3-5:bcIRF5expressioninMPKcells.MPKcellsin6-wellplate(2×106cells/well)weretreatedwithPoly(I:C)(A)orLPS(B)atindicatedconcentrationseparately;orinfectedwithSVCV(C)orGCRV(D)atindicatedMOIseparately.CollectcellsatdifferenttimepointsandextracttheirtotalRNA,andthentherelativeexpressionlevelofbcIRF5mRNAwasdetectedafterreversingtoqPCRtemplate.3.5bcIRF5蛋白的表达为明确bcIRF5在体外培养的细胞系中的过表达情况，我们分别构建了pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag。我们选取了两种具有代表性的细胞系（EPC和HEK-293T细胞）来进行真核细胞过表达实验。我们的结果显示，不管是在这一常用的鱼类相关研究细胞系（EPC细胞）还是在HEK293T细胞这一高效表达外源基因的哺乳动物细胞系中，bcIRF5均能成功表达。在这两种细胞中，分别由pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag表达的蛋白条带大小均为65kDa，如图3-6。由于
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 张媛媛,宋理平. 河北渔业. 2018(02)
[2]鱼类免疫应答机制研究进展[J]. 白姗姗,贾智英,石连玉. 水产学杂志. 2017(04)
[3]鱼类的免疫及存在的问题(上)[J]. 孟思妤,孟长明,陈昌福. 科学养鱼. 2015(11)
[4]青鱼鱼病概况及其防治策略[J]. 吴宇略. 渔业致富指南. 2010(21)
[5]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 王俊相,李玉萍,孔令富,李莲军. 四川畜牧兽医. 2010(07)
[6]浅谈鱼类免疫系统[J]. 黄宁,陈学群. 福建畜牧兽医. 2005(06)
[7]Ⅰ型干扰素及其在抗病毒和抗细菌感染中的作用[J]. 陈刚,郑大海,杨仉生,程根宏,唐宏. 中国免疫学杂志. 2005(02)
[8]鱼类胸腺研究进展[J]. 谢海侠,聂品. 水产学报. 2003(01)
[9]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 孙德文,詹勇,许梓荣. 水利渔业. 2002(06)
[10]鱼类体液免疫因子研究进展[J]. 张永安,聂品. 水产学报. 2000(04)
本文编号：3600156
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