RNAi沉默CAPN1基因对Aβ25-35诱导的原代神经元细胞损伤及凋亡的影响

发布时间：2022-02-17 09:06

　　目的与背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的慢性神经退行性疾病,在AD病变中钙蛋白酶过度活化,加剧AD疾病进展。因此,抑制钙蛋白酶对治疗AD具有重要意义,但因钙蛋白酶种类繁多,参与多种生理活动。目前尚无特异性的钙蛋白酶抑制剂。因此,本研究采用RNAi沉默CAPN1基因,利用Aβ25-35诱导的AD样细胞模型,观察RNAi沉默CAPN1表达对Aβ25-35诱导的原代皮层神经细胞的神经毒性及凋亡的影响。方法:实验分组:1)原代胎鼠皮层神经元+PBS;2)原代胎鼠皮层神经元+阴性参照毒液+10μM Aβ25-35;3)原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35;4)原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35+2ug/ml p25;各组转染慢病毒48小时后,再加各种药物,再培养72h。CCK-8法检测神经元细胞活力的变化情况,Annexin V-PI方法进行细胞凋亡检测,Real-Time PCR检测转染CAPN1 RNAi后CAPN1 mRNA的表达水平,Western blotting检测... 

【文章来源】：南昌大学江西省211工程院校

【文章页数】：46 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 阿尔茨海默病发病机制进展
    1.2 阿尔茨海默病与细胞凋亡
    1.3 μ-calpain与凋亡途径
第2章 材料与仪器
    2.1 材料
        2.1.1 实验细胞
        2.1.2 主要试剂
    2.2 主要仪器
第3章 实验方法
    3.1 主要溶液配制
    3.2 CAPN1 shRNA重组慢病毒载体构建(neuro-2a-CAPN1 shRNA)筛选
    3.3 原代皮层神经元细胞培养
    3.4 实验分组
    3.5 CCK-8法观察各组细胞活力的变化
    3.6 Annexin V/PI流式检测
    3.7 实时荧光定量PCR检测μ-calpain的表达变化
        3.7.1 细胞总RNA提取
        3.7.2 mRNA逆转录反应体系
        3.7.3 mRNA实时荧光定量反应体系
        3.7.4 定量PCR反应程序
    3.8 westernblot(WB)方法检测细胞内相关蛋白的表达
        3.8.1 提取细胞总蛋白
        3.8.2 BCA法测蛋白浓度
        3.8.3 凝胶配制
        3.8.4 电泳、转膜、封闭、孵育抗体及显影
    3.9 统计学处理
第4章 结果
    4.1 慢病毒介导μ-calpain基因有效干扰片段筛选
    4.2 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞活力的影响
    4.3 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞凋亡的影响
    4.4 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞CAPN1mRNA表达水平的影响
    4.5 RNAi沉默CAPN1基因对神经元细胞相关蛋白表达水平的影响
第5章 讨论
    5.1 Aβ25-35诱导的细胞损伤及凋亡的影响
    5.2 RNAi沉默CAPN1基因对Aβ25-35诱导的神经毒性作用及CDK5/GSK-3β通路的影响
    5.3 p25在RNAi沉默CAPN1基因中对Aβ25-35引起的CDK5/GSK-3β通路的影响
第6章 结论与展望
    6.1 全文总结
    6.2 不足之处与展望
致谢
参考文献
附录：本研究资助项目
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]A possible therapeutic potential of quercetin through inhibition of μ-calpain in hypoxia induced neuronal injury:a molecular dynamics simulation study[J]. Anand Kumar Pandey,Swet Chand Shukla,Pallab Bhattacharya,Ranjana Patnaik.  Neural Regeneration Research. 2016(08)



本文编号：3629155