Akirin基因调控鸭成肌细胞增殖与分化的作用研究

发布时间：2022-02-27 09:11

　　Akirin基因家族在骨骼肌发育上具有重要作用。该基因家族有两个成员,Akirin1和Akirin2,研究报道鸟类基因组仅含有一个成员Akirin2。为研究鸟类Akirin2基因的功能,在鸭成肌细胞中过表达Akirin2基因、异源表达鼠Akirin1基因后,结合荧光定量、免疫荧光、蛋白印迹以及流式细胞术等手段,研究了Akirin2基因在鸭成肌细胞中的作用。主要研究结果如下:（1）将鼠Akirin1与Akirin2基因分别与多个鸟类基因组比对分析,仅在鸟类基因组中发现一个Akirin同源基因。该同源基因与鼠Akirin2基因有着80%以上的同源性,而与鼠Akirin1基因仅有41%⁴5%的同源性。进化树结果显示,所选鸟类Akirin同源基因与其他物种Akirin2聚为一类。结构功能域分析结果显示,所选鸟类Akirin结构域与其他物种Akirin2高度相似。（2）通过低浓度马血清成功将鸭成肌细胞进行诱导分化。成功构建鸭Akirin2基因真核表达载体并将其转染至鸭成肌细胞后,生肌调控因子（MRFs）、肌细胞增强因子2（MEF2s）基因家族各成员的表达量、细胞周期的退出与... 

【文章来源】：四川农业大学四川省211工程院校

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号说明
第一章 文献综述
    1 成肌细胞与生肌调控
        1.1 成肌细胞的起源
        1.2 成肌细胞的增殖与分化过程
        1.3 调控成肌细胞增殖与分化的关键因子
            1.3.1 生肌调控因子
                1.3.1.1 生肌决定因子(MyoD)
                1.3.1.2 成肌因子5(Myf5)
                1.3.1.3 肌细胞生成素(MyoG)
                1.3.1.4 成肌调节因子4(MRF4)
            1.3.2 肌细胞増强因子2(Myocyte Enhacer Factors2,MEF2s)
                1.3.2.1 肌细胞増强因子2A(MEF2A)
                1.3.2.2 肌细胞増强因子2B(MEF2B)
                1.3.2.3 肌细胞増强因子2C(MEF2C)
                1.3.2.4 肌细胞増强因子2D(MEF2D)
            1.3.3 细胞周期调控因子
        1.4 调控成肌细胞增殖与分化的信号通路
            1.4.1 MAPK信号通路
            1.4.2 PI3K/Akt信号通路
    2 Akirin基因家族研究进展
        2.1 发现与成员命名
        2.2 基因组结构组成及分子进化
        2.3 表达模式
        2.4 主要功能
            2.4.1 Akirin基因与骨骼肌发育
            2.4.2 Akirin基因与先天性免疫
            2.4.3 Akirin基因与肿瘤发生
    3 鸟类Akirin2 基因研究进展
    4 研究内容和目的意义及研究思路
        4.1 研究内容和目的意义
        4.2 技术路线
第二章 Akirin基因家族分子进化分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 所用网站
        2.2 所用软件
        2.3 系统进化树构建
    3 结果与分析
        3.1 鸟类Akirin基因blast比对分析
        3.2 Akirin基因家族系统进化分析
        3.3 Akirin基因家族保守蛋白结构域分析
    4 讨论
    5 小结
第三章 过表达Akirin2 对鸭成肌细胞分化的影响
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 试验动物与试剂
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 药品和试剂
            2.1.3 主要试验仪器
            2.1.4 常用试剂配制
        2.2 试验方法
            2.2.1 总RNA的提取及质量检测
            2.2.2 cDNA的合成
            2.2.3 鸭Akirin2 基因真核表达载体构建及酶切鉴定
            2.2.4 鸭成肌细胞培养
            2.2.5 鸭成肌细胞诱导分化
            2.2.6 成肌细胞RNA的提取及反转录
            2.2.7 实时荧光定量PCR
            2.2.8 Western Blot
            2.2.9 细胞周期测定
            2.2.10 My HC免疫荧光染色
        2.3 数据统计
    3 结果与分析
        3.1 鸭成肌细胞分化过程中生肌调控因子表达模式
        3.2 鸭pEGFP-N1-Akirin2 载体转染效率
        3.3 过表达鸭Akirin2 基因对MRFs和 MEFs表达的影响
        3.4 过表达鸭Akirin2 基因对成肌细胞细胞周期的影响
        3.5 过表达鸭Akirin2 基因对My HC表达的影响
    4 讨论
    5 小结
第四章 过表达Akirin2 对鸭成肌细胞增殖的影响
    1 前言
    2 试验材料与方法
        2.1 试验动物与试剂
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 药品和试剂
            2.1.3 主要试验仪器
            2.1.4 常用试剂配制
        2.2 试验方法
            2.2.1 总RNA的提取及质量检测
            2.2.2 cDNA的合成
            2.2.3 鸭pEGFP-N1-Akirin2 载体的构建
            2.2.4 鸭成肌细胞培养
            2.2.5 pEGFP-N1-Akirin2 重组质粒转染以及雷帕霉素处理成肌细胞
            2.2.6 成肌细胞RNA的提取及反转录
            2.2.7 实时荧光定量PCR
            2.2.8 Western Blot
            2.2.9 CCK-8 细胞增殖活性检测
        2.3 数据统计
    3 结果与分析
        3.1 过表达鸭Akirin2 对成肌细胞细胞活性的影响
        3.2 过表达鸭Akirin2 对周期因子表达的影响
        3.3 过表达鸭Akirin2 基因对蛋白代谢调控因子表达的影响
        3.4 雷帕霉素对鸭Akirin2 基因调控胞内蛋白代谢相关因子表达的影响
    4 讨论
    5 小结
第五章 miR-365 介导Akirin2 表达对鸭成肌细胞增殖的影响
    1 前言
    2 试验材料与方法
        2.1 试验动物与试剂
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 药品和试剂
            2.1.3 主要试验仪器
            2.1.4 常用试剂配制
        2.2 试验方法
            2.2.1 总RNA的提取及质量检测
            2.2.2 cDNA的合成
            2.2.3 双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建
            2.2.4 鸭成肌细胞培养
            2.2.5 实时荧光定量PCR
            2.2.6 Western Blot
            2.2.7 BrdU免疫荧光染色
        2.3 数据统计
    3 结果与分析
        3.1 不同物种Akirin23’UTR区域保守性分析
        3.2 鸭Akirin23’UTR的 microRNA预测及双荧光素酶报告载体构建
        3.3 过表达miR-365 对鸭成肌细胞增殖活性的影响
        3.4 过表达miR-365 对胞内蛋白代谢相关因子表达的影响
        3.5 过表达miR-365 对周期蛋白相关调控因子表达的影响
    4 讨论
    5 小结
第六章 异源表达Akirin1 影响鸭成肌细胞分化的分子机制
    1 前言
    2 试验材料与方法
        2.1 试验动物与试剂
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 药品和试剂
            2.1.3 主要试验仪器
            2.1.4 常用试剂配制
        2.2 试验方法
            2.2.1 总RNA的提取及质量检测
            2.2.2 cDNA的合成
            2.2.3 鼠pEGFP-N1-Akirin1 载体构建
            2.2.4 鸭成肌细胞培养
            2.2.5 鸭成肌细胞诱导分化
            2.2.6 pEGFP-N1-Akirin1与LY294002或SB203580 处理成肌细胞
            2.2.7 成肌细胞RNA的提取及反转录
            2.2.8 实时荧光定量PCR
            2.2.9 Western Blot
            2.2.10 细胞周期测定
            2.2.11 免疫荧光染色
        2.3 数据统计
    3 结果与分析
        3.1 pEGFP-N1-Akirin1 载体转染效率检测
        3.2 异源表达鼠Akirin1 基因对生肌调控因子表达的影响
        3.3 异源表达鼠Akirin1 基因对p38MAPK信号通路相关因子表达的影响
        3.4 SB203580 与鼠Akirin1 共处理对p38MAPK/MRF4 相关基因表达的影响
        3.5 异源表达鼠Akirin1 基因对生肌调控因子增强子表达的影响
        3.6 异源表达鼠Akirin1 基因对IGF-II/PI3K/Akt相关因子表达的影响
        3.7 LY294002 与鼠Akirin1 共处理对IGF-II/PI3K/Akt相关基因表达的影响
        3.8 异源表达鼠Akirin1 基因对成细胞周期相关因子表达的影响
        3.9 LY294002 与鼠Akirin1 共处理对细胞周期相关因子表达的影响
        3.10 异源表达鼠Akirin1 基因对成肌细胞肌管生成的影响
    4 讨论
    5 小结
第七章 总结
    1 主要结论
    2 创新点
    3 下一步需开展的工作
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]兴义鸭MEF2D基因的多态性及组织差异表达研究[J]. 师新彩,赵忠海,李辉,卜小雁,易恒洁,陈林.  农业生物技术学报. 2018(02)
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博士论文
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硕士论文
[1]兴义鸭MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D基因克隆与组织时空表达研究[D]. 赵忠海.贵州大学 2016
[2]山羊MEF2基因家族的克隆及其组织表达规律的研究[D]. 程波.四川农业大学 2012
[3]鸭MyoG、MRF4基因的克隆及其在骨骼肌组织中的发育表达研究[D]. 贾径.四川农业大学 2009
[4]鸭MEF2家族的克隆及组织表达研究[D]. 司建民.四川农业大学 2009
[5]猪MEF2C和MEF2D基因定位及MEF2C基因的表达研究[D]. 吴俊红.浙江大学 2009
[6]猪骨骼肌卫星细胞的培养、鉴定及猪MEF2B和MEF2C基因的初步研究[D]. 何波.华中农业大学 2006



本文编号：3645175